细胞角蛋白20单克隆抗体免疫胶体金试纸条的研制

目的研制用于尿液检查的细胞角蛋白20单克隆抗体免疫胶体金试纸条(CK20试条),建立一种无创性筛选诊断和检测膀胱癌复发的新的检测手段。方法将经处理的CK20单抗标记在胶体金颗粒上并活性进行鉴定,合格后吸附在硝酸纤维膜上并固定在长方形硬质塑料胶片一端为测定线;同时将吸附有IgG蛋白胶体金的硝酸纤维膜固定在测定线的一侧为质控线。将制成的CK20试条吸样端浸入尿液测定。结果成功的制备CK20试条,初步临床用于膀胱癌检测,敏感性78%(39/50),特异性为87%。结论采用该方法制备的CK20试条对膀胱癌患者尿液的检测具有较好的灵敏度和特异性,可用于膀胱癌瘤患者筛检诊断和复发的检测。

抗CCL20单克隆抗体对血清淀粉样蛋白A相关的结节病中促炎性细胞因子的抑制作用

目的探讨抗CCL20单克隆抗体是否可抑制高水平血清淀粉样蛋白A(SAA)相关的结节病外周血单个核细胞(PBMC)中促炎性细胞因子的表达。方法提取健康人和结节病患者的PBMC,并进行分组。除空白对照组(正常人PBMC)和结节病PBMC对照组(患者PBMC)外,另将结节病组PBMC中分别加入SAA、SAA+抗CCL20单克隆抗体、SAA+NF-κB抑制剂BAY11-7082或地塞米松,经培养48 h后收集各组细胞,分别作为PBMC+SAA刺激组、PBMC+SAA+NF-κB抑制剂BAY11-7082组、PBMC+SAA+抗CCL20单抗组、PBMC+地塞米松干预组,使用ELISA分别测定各组细胞上清液中细胞因子IL-17A、IL-23、IL-6、CCL20和TGF-β1的表达,使用RT-PCR测定各组细胞中CCR6、IL-17、ROR-γt和Foxp3的mRNA表达水平,使用Western blot检测各组细胞中p-NF-κB和NF-κB蛋白的表达水平。结果PBMC+SAA+抗CCL20单抗组与PBMC+SAA组相比,细胞上清液中的IL-17A、IL-23和IL-6的水平显著降低(P<0.01),而TGF-β1的含量显著升高(P<0.01)。PBMC+SAA+抗CCL20单抗组相较于PBMC+SAA组,细胞中CCR6、IL-17A、ROR-γtmRNA水平显著降低(P<0.01),而Foxp3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。PBMC+SAA+抗CCL20单抗组中p-NF-κB蛋白表达水平较PBMC+SAA组明显降低(P<0.01)。结论抗CCL20单克隆抗体可抑制高水平SAA相关的结节病PBMC中促炎性细胞因子的表达。

抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白单克隆抗体的制备及其在荧光检测中的应用

【目的】探究鸡早幼粒细胞白血病蛋白核小体(PML NBs)在马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的生物学功能,制备抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白(Ch-PML)单克隆抗体,建立可视化检测Ch-PML的方法。【方法】通过原核表达系统制备Ch-PML重组蛋白,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将骨髓瘤细胞和免疫小鼠的脾细胞进行融合,用ELISA方法筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,通过体内诱生法制备腹水并用Protein A/G纯化抗Ch-PML单克隆抗体,利用Western blotting和ELISA方法检测单克隆抗体的特异性、亲和力和亚类,最后利用该单克隆抗体建立用于鸡PML NBs的间接免疫荧光试验(IFA)检测方法。【结果】Ch-PML蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量大小为19 ku;以此蛋白成功制备了1株抗Ch-PML单克隆抗体,该抗体具有良好的特异性和高亲和力,经亚类和型检测,其为IgG2b亚类,轻链为Kappa型。利用制备的抗Ch-PML单克隆抗体建立的IFA检测方法发现,内源性PML NBs在宿主细胞核中呈点状分布,过表达的Ch-PML在宿主细胞核中形成团块状聚集体,且MDV感染宿主细胞后核内PML NBs数量比未感染细胞显著减少(P<0.05),说明MDV感染导致核内的PML NBs组装受到抑制。【结论】本研究利用制备的抗Ch-PML单克隆抗体建立了鸡PML NBs的IFA检测方法,并发现MDV抑制宿主细胞PML NBs组装这一现象,为MDV致病机制的解析提供了新的研究思路和工具。

牛早幼粒细胞白血病蛋白的原核表达及单克隆抗体制备

【目的】牛早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)是细胞核亚结构PML核体(nuclear bodies,NBs)的骨架蛋白,在抗病毒内源性免疫中发挥重要作用。本研究旨在制备牛PML单克隆抗体,为研究PML NBs结构和功能准备物质材料。【方法】构建表达bPML基因截短体的重组质粒pET-32a-bPML,将重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析。将经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,应用ELISA方法鉴定单克隆抗体类/亚类和型,进一步鉴定该单克隆抗体识别的抗原表位;通过检测不同种属来源的细胞检测单克隆抗体的特异性;利用该单克隆抗体对外源转染牛PML的细胞进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测;利用该单克隆抗体建立的IFA检测不同的牛源细胞内源PML定位情况。【结果】牛PML在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量大小为50 ku;以此纯化蛋白为免疫原制备出1株抗牛PML单克隆抗体bPML-2G5,其为IgG1亚类,轻链为Kappa型,识别表位位于牛PML结构域78 EQPRPSTSRA 88;Western blotting和IFA分析结果显示,bPML-2G5不仅可特异性识别外源转染的牛PML,而且还能特异性识别牛肾细胞、牛鼻甲骨细胞、牛胚气管细胞的胞核内核体结构中的PML。【结论】本研究成功制备了1株分泌牛PML单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体可用于检测外源性及内源性表达的牛PML。

抗角蛋白16单克隆抗体对角质形成细胞增殖活性的影响

目的研究抗角蛋白单克隆抗体(mAb)对体外培养的角质形成细胞增殖活性与细胞周期的影响。方法以无血清培养基体外原代培养角质形成细胞。应用3H-TdR掺入DNA合成测定法,观察抗角蛋白16mAb(anti-K16mAb)对角质形成细胞代谢增殖的影响。用流式细胞仪分析anti-K16mAb作用后角质形成细胞的细胞周期变化。结果mAb作用后,角质形成细胞样品的cpm降低,并呈抗体剂量依赖方式。流式细胞仪分析表明,处于S期的细胞比例由27%上升至42.2%,同时处于G1期与G2期的细胞比例分别相应下降。结论anti-K16mAb可抑制体外培养的角质形成细胞的增殖活性,且将细胞阻滞于S期,无法进入G2期与M期分裂增殖。

抗人乳腺癌细胞膜表面角蛋白CK8的单克隆抗体的制备及鉴定

目的:建立针对多药耐药人乳腺癌细胞膜表面差异抗原的抗体库,并鉴定抗角蛋白CK8特异性的单克隆抗体。方法:采用细胞免疫和杂交瘤技术制备单克隆抗体库,经免疫沉淀得到抗原-抗体复合物,SDS-PAGE分离目的抗原,质谱测序,Western blot验证及激光共聚焦显微镜观察抗原分子的细胞膜定位。结果:成功筛选到稳定分泌抗CK8分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(7F9)。结论:文中所研制的单克隆抗体具有与乳腺癌细胞膜表面CK8分子特异结合的活性,在上皮来源肿瘤标志物CK8的临床检测及CK8相关生物学活性研究中具有广泛应用前景。

猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子的原核表达及单克隆抗体制备

【目的】制备猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)及其单克隆抗体,为建立猪源SLPI检测方法及其功能研究提供试验材料。【方法】将经串联的猪源SLPI基因克隆至pET-28a(+)、pGEX-6P-1载体构建重组表达载体;利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况;重组菌经超声破碎以镍柱对重组蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合制备杂交瘤细胞,采用间接ELISA筛选和鉴定所制备单克隆抗体和亚类,利用Western blotting及间接免疫荧光(IFA)方法鉴定单克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建了pGEX-6P-1-SLPI、pET-28a-SLPI重组质粒,获得纯度较高的His-SLPI、GST-SLPI重组蛋白,分子质量分别为27和50 ku,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达;获得3株可稳定分泌抗猪SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,9D10为IgG3亚类,9G11、10E2为IgG2b亚类;3株单克隆抗体均可与猪肠上皮细胞内的SLPI结合,9D10在细胞核中显示较强的荧光信号,而9G11、10E2在细胞浆和细胞核中均有荧光信号。【结论】本研究成功制备了重组His-SLPI和GST-SLPI蛋白,获得3株稳定分泌抗猪源SLPI单克隆抗体,特异性良好,为进一步研究猪源SLPI特性及其在黏膜免疫中的作用搭建技术平台。

细胞角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色方法检测大肠癌淋巴结微转移的研究

目的为研究角蛋白克隆抗体免疫组织化学法在检测淋巴结微转移灶上的意义。方法采用三种角蛋白单克隆抗体AE1,AE3、AE1/AE3,对我院47例大肠癌术后患者331个淋巴结用免疫组织化学法重新检查。结果36个淋巴结存在微转移灶(11.9%),Duke'sC期患者微转移灶检出率高于Duke'B期患者(P<0.05)。随访显示有微转移灶Duke'B期病人肿瘤复发、远处扩散转移均较无微转移病人高(P<0.05)。结论即使是组织学检查结果为阴性的淋巴结,也很有存在微转移的可能性。免疫组织化学法栓测单克隆抗角蛋白抗体,可详细阐明临床分期,并可提供大肠癌治疗的指征。

抗角蛋白14单克隆抗体对无血清培养角质形成细胞增殖的影响

目的:建立一种无血清传代培养人角质形成细胞(KC)的方法,并观察角蛋白14单克隆抗体(anti-K14 mAb)对无血清培养人角质形成细胞体外增殖的影响。方法:应用角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)添加重组表皮生长因子(EGF)和牛垂体浸出液(BPE)传代培养角质形成细胞,培养均至第3代时于培养基中加人不同浓度的anti-K14 mAb,用MTT法观察对角质形成细胞增殖的影响。结果:应用无血清培养基成功地传代培养了角质形成细胞,MTT法结果显示各浓度组对培养的角质形成细胞的增殖有显著抑制作用并有浓度依赖性。结论:建立了一种无血清培养人角质形成细胞的方法a,nti-K14mAb对人角质形成细胞体外的增殖有显著抑制作用。

一株新型抗46 ku-细胞角蛋白的单特异性单克隆抗体(英文)

利用杂交瘤技术制备了一株单克隆抗体 T2-2,对其生化性质的研究及其与抗细胞角蛋白多克隆抗体完全重合的定位表明,该抗体特异性识别一种分子质量为 46 ku 的角蛋白. 对 68 例正常组织和 65 例肿瘤组织的免疫组化结果显示,单克隆抗体 T2-2 具有上皮细胞特异性. 与其他多数抗细胞角蛋白抗体常与一种以上细胞角蛋白多肽表现出交叉反应不同的是,该抗体只识别 46 ku 细胞角蛋白多肽上的某一单特异性表位. 另外,单克隆抗体 T2-2 适用于多种免疫实验技术,包括 ELISA、免疫组化、细胞免疫荧光及蛋白质印迹等,而且适用于多种固定剂. 以上结果表明,单克隆抗体 T2-2 将成为细胞角蛋白功能研究和肿瘤诊断的有力工具.

抗角蛋白单克隆抗体5G5对角质形成细胞增殖影响的实验研究

目的 研究抗角蛋白单克隆抗体 5G 5治疗银屑病的作用机制。方法 腹腔注射乙烯雌酚有引起小鼠阴道上皮细胞增殖的作用 ,小鼠尾部表皮天然缺乏颗粒层 ,这两种特征与银屑病病理类似。不同组别的小鼠 ,以单抗 5G 5注射 ,观察其对角质形成细胞增殖的调节作用。结果 单抗 5G 5有较好的降低嗜银蛋白含量和小鼠阴道上皮细胞有丝分裂 ,以及促使角质形成细胞分化的作用。结论 抗角蛋白单克隆抗体 5G

抗人细胞角蛋白7(CK7)单克隆抗体的制备及鉴定

用KLH偶联合成细胞角蛋白7(CK7)优势表位多肽片段(C14)免疫小鼠,经细胞融合技术制备CK7单克隆抗体(mAb),并收集临床组织进行免疫组化鉴定。C14多肽作为抗原具有良好的免疫反应性。本研究共获得了3株能稳定分泌抗CK7抗体的单克隆细胞株,选择亲和力较好的7A8单克隆抗体进行免疫组化鉴定,结果表明,本研究筛选的7A8单克隆抗体的质量浓度为0.49μg/mL时,与收集的临床标本均有良好的特异性反应,低于医院常用CK7检测试剂盒中抗体质量浓度2~5μg/mL,表现出较高的灵敏度。本研究筛选的7A8单克隆抗体为研发CK7快速诊断试剂提供了关键的原材料。

表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化

在自主研发无蛋白培养基的基础上,考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的影响。结果表明,对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充,虽然不能促进细胞生长,但有利于培养后期细胞活性维持与抗体合成;B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间;作为重要的碳源和能源,葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长,而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成,维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间,从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基,CHO细胞在该培养基中的最高密度达到52.6×105cells mL 1,抗体产量达到274 mg L 1,与初始培养基相比分别提高了33%和63%。总之,在细胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分,以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。

鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51200和1∶102400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。

高尔基蛋白73单克隆抗体在肝细胞肝癌诊断中的价值

目的自制高尔基蛋白73(GP73)单克隆抗体并检测其诊断肝细胞肝癌(HCC)的敏感性和特异性。方法自行制备GP73单克隆抗体,作为一抗用Western blot方法检测59例HCC患者和31名健康对照者血清中GP73蛋白的表达情况,并对结果进行半定量分析,确定对照组人群的正常基线水平。将此结果同多克隆抗体的检测结果及甲胎蛋白(AFP)的诊断结果进行比较。结果使用单克隆抗体检测健康人群的血清GP73水平为1.2(0.9-1.7)相对单位(RU),HCC患者血清GP73水平为5.7(2.5-7.8)RU,显著高于对照组水平(P<0.001);多克隆抗体检测结果显示,HCC患者血清GP73水平与对照组相比[7.8(3.0-12.4)RU比1.1(1.0-2.0)RU]亦显著增高(P<0.001)。GP73单抗诊断HCC的敏感性和特异性分别为84.7%和93.5%,对比多抗的敏感性(78.0%)和特异性(93.5%),前者敏感性有所增高;同组患者采用AFP诊断HCC的敏感性和特异性分别为67.8%和74.2%,均低于GP73单抗。Logistic回归分析显示,GP73单抗的优势比(OR)为7.18,而GP73多抗的OR为1.51。结论单克隆抗体可以有效地检测肝癌患者血清GP73水平,比AFP具有更高的敏感性和特异性;可能优于目前使用的GP73多克隆抗体的检测。这一结果为用自制单抗进一步开发酶联免疫方法检测奠定了基础。

抗猪脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以纯化的猪脂肪细胞特异膜蛋白 (40 0 0 0 )为抗原免疫 BAL B/ c小鼠 ,制备了 2 A3、3 H7和 3 A6等 3株单克隆抗体 ,分别属于 Ig A、Ig M和 Ig G1亚类 ,其最佳稀释倍数分别为 1∶ 1 6 0 0、1∶ 3 2 0 0和 1∶ 6 4 0 0。经 Western blotting鉴定 ,3株单抗均能与 4 0 0 0 0的抗原结合 ,且具有较强的抗原亲和力 ,亲和常数分别为 4 .86× 1 0 8、1 .86× 1 0 9和 2 .4 6× 1 0 9;对皮下脂肪细胞具有很强的特异性 ,经 Western blotting鉴定仅与猪和人脂肪细胞的 4 0 0 0 0膜蛋白发生特异反应 ,而与牛、羊、兔、鸡、鼠等动物的脂肪细胞膜蛋白均无交叉反应 ;能与滇玉、滇昆、滇陆、长撒、长白、DL Y、约长撒和撒坝等品种猪皮下脂肪细胞的 4 0 0 0 0膜蛋白发生特异反应 ,而与皮下脂肪细胞的其他膜蛋白无交叉反应 ;仅与长撒猪皮下脂肪和腹部脂肪细胞的 4 0 0 0 0膜蛋白发生特异反应 ,与心、肝、脾、肺、肾、肌肉。

抗人CD20单克隆抗体诱导Daudi细胞凋亡的功能研究

目的 观察由基因重组抗原制备的抗人CD2 0单克隆抗体 (CD2 0 McAb) 1- 2 8对B淋巴瘤细胞的促凋亡作用 ,并探讨其作用机理。方法 利用流式细胞术测定所获 1- 2 8单抗对标准CD2 0 FITC单抗的竞争抑制作用及对胞内游离钙的影响 ;通过电镜观察其诱导Daudi细胞凋亡后形态上的改变 ,免疫印迹实验显示Daudi细胞凋亡后功能上的变化。结果 1- 2 8能明显竞争标准CD2 0 FITC单抗与Daudi细胞表面CD2 0分子的结合。电镜结果证实了 1- 2 8能够促进Daudi细胞发生凋亡的结论 ;实验结果显示Daudi细胞与 1- 2 8作用后胞内游离钙浓度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,细胞内Bcl 2蛋白和caspase酶原的表达量下降 ,而Bax蛋白和caspase酶原降解的活性产物表达增加。结论 1- 2 8能竞争结合Daudi细胞表面的CD2

抗CD20单克隆抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的实验观察

目的:以人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型为基础,研究抗CD20单克隆抗体体内、体外活性,评价该抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的有效性。方法:体内实验:建立人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型。52只荷瘤鼠随机分为5组进行实验。用TUNEL法检测肿瘤凋亡,并绘制肿瘤体积曲线和裸鼠体质量曲线。体外实验:用CellTiter96 AQueous非同位素细胞增殖试验试剂盒检测抗CD20单克隆抗体、化疗和联合化疗对Raji细胞体外杀伤作用,并绘制剂量反应曲线。结果:体内实验:鼠抗人CD20单抗组及嵌合CD20抗体组均出现大量肿瘤细胞凋亡。联合治疗组疗效最佳,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。化疗组及联合治疗组体质量下降明显,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。体外实验:发现鼠抗人CD20单克隆抗体及嵌合型CD20抗体均可增加Raji细胞对化疗药物的细胞毒敏感性。结论:CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤具有明显的抑制作用,可以诱发大面积肿瘤细胞凋亡,能提高肿瘤对化疗药物的细胞毒敏感性,且较常规化疗毒副反应小。