气相色谱/质谱法检测壬基酚在大鼠睾丸支持细胞中的分布

壬基酚(NP)是一种环境内分泌干扰物,具有类雌激素作用,它的高稳定性和脂溶性的特点使其能够在有机体,特别是脂肪组织内聚集,对人类的生殖系统产生毒害作用,因其分子结构与细胞膜的磷脂分子很相似,故与磷脂分子有很高的亲和力.为了探讨NP对生殖细胞的毒理机制,了解其在细胞内的分布情况,建立大鼠睾丸支持细胞NP含量的高效气相色谱及质谱(即GC/MS)检测方法,观察NP在细胞中的分布.实验采用原代培养的大鼠睾丸支持细胞,通过带有CY3标记的抗体对其质膜上特异表达的卵泡刺激素受体(FSHR)进行免疫荧光染色,鉴定支持细胞.然后用10μmol/L和20μmol/L的NP分别作用细胞3 h6、h1、2 h2、4 h后,超声破碎,并对10μmol/L NP处理的样品用改进的三步离心法进行细胞质膜分离,GC/MS方法检测NP在细胞中的总含量,以及细胞膜中NP含量占细胞中的总含量的比例.结果显示培养的细胞均呈现绿色荧光,都表达FSHR.两步离心的质膜分离方法,膜纯度为33.22%,改进的三步离心法膜纯度为78.60%.另外,分别在10μmol/L和20μmol/L NP浓度下,随着作用时间的延长,NP在细胞中的总含量逐渐增加至12 h,在24 h时突然下降至3 h的水平.细胞膜中NP含量占细胞中的总含量的比例,随着作用时间的延长而降低.由此得出结论是:FSHR可以作为大鼠睾丸支持细胞的鉴定指标;三步离心的质膜分离方法得到的膜纯度远远高于两步离心法;虽然NP与磷脂分子有很高的亲和力,但随着作用时间的延长,NP并没有停留在细胞膜里,而是能够穿过细胞膜进入到细胞内,并主要分布在细胞内.