细胞外基质促日本血吸虫培养细胞贴壁作用的研究

目的 研究肝、肺生物基质及鼠尾胶三种细胞外基质 (ECM )对日本血吸虫培养细胞的促贴壁作用。方法 灌注法获取 2 1d虫龄的日本血吸虫虫体 ,冷消化法制备细胞悬液 ,将密度为 2× 10 6/ml的细胞悬液分别接种于均匀铺敷三种基质及未铺敷基质 (对照 )的各组培养瓶中进行培养 ,定时计数贴壁细胞数 ,计算贴壁率。结果 随着培养时间从 8h— 4 8h ,各组日本血吸虫细胞的贴壁率逐渐增高 ,4 8h后下降。同一培养时间 ,基质不同 ,细胞的贴壁率不同。培养 4 8h时细胞的贴壁率 ,鼠尾胶组、肝与肺基质组分别为 6 3 2 7%、4 8 95 %、4 5 36 % ;统计学处理发现 ,它们之间差异显著 ;鼠尾胶组与肝、肺基质组比较 ,p <0 0 1;肝与肺基质组之间比较 ,p <0 0 5 ;对照组与各基质组比较 ,均具显著差异 (p <0 0 1)。 结论 ECM对日本血吸虫培养细胞具有明显的促贴壁作用。其中 ,鼠尾胶对日本血吸虫细胞的促贴壁作用最强 ,其次是肝生物基质 ;肺生物基质的促贴壁作用相对较弱 ,但也强于对照组 (p <0 0 1)。

体外培养成肌细胞贴壁速度与细胞物理性状及成熟度间的关系

目的:探讨体外培养成肌细胞差速贴壁机制,研究成肌细胞不同贴壁速度与物理性状和成熟度间的关系。方法:分离SD大鼠后肢肌肉获得成肌细胞,体外培养第3代时采用差速贴壁法传代,分别在贴壁20min、1、2、26h时收获细胞,流式细胞仪按照一定阈值检测细胞的前向角散射(forward scatter,FSC)、侧向角散射(side scatter,SSC)分布及CD34、Pax7、M-cadherin的表达情况。将原代成肌细胞进行六步Percoll密度梯度离心分离,流式细胞仪检测各组细胞CD34、Pax7、M-cadherin的表达。结果:流式细胞仪检测显示,成肌细胞第3代经差速贴壁法传代后快速贴壁细胞在阈值范围内FSC的阳性细胞少,SSC的阳性细胞多,而贴壁较慢的细胞则反之,26h后还未贴壁的细胞在阈值范围内FSC、SSC细胞分布更少;说明早期贴壁细胞小,所含颗粒多,稍晚贴壁细胞面积大,所含颗粒少,26h后还未贴壁是更为幼稚的细胞。CD34、Pax7等阳性细胞主要出现在较晚贴壁的细胞中。流式细胞仪检测Percoll密度梯度离心分离原代成肌细胞的不同亚群,结果显示在15%～25%Percoll分离组分中富集CD34、Pax7阳性细胞。结论:细胞贴壁速度与物理性状和成熟度密切相关,可以采用15%～25%Percoll密度梯度离心法快速分离具有干细胞特征的肌肉形成细胞。

连续微量培养液强行细胞贴壁培养法

随着医学科学技术的发展，组织细胞培养技术的建立与应用，不仅促进了细胞生物学、病毒学和细胞免疫学研究的进展，也推动了诸如分子免疫学、分子细胞学、分子遗传学，以及基因诊断、基因治疗等方面的研究进展，但在实际进行细胞原代培养中仍然困难很多。细胞能否生长的关...

不同浓度奶牛乳腺上皮细胞和奶牛脐带间充质干细胞共培养对细胞贴壁率的影响

为了研究在不同浓度下奶牛脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)共培养对细胞贴壁率的影响。本试验将P3代UC-MSCs与P3代BMECs按照浓度比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶1 000、2∶1等不同比例随机混合培养,同时设立UC-MSCs与BMECs单纯培养组为对照组,并分别于0、24、48、72、96、120、144 h时观察各组细胞的形态变化,测定细胞贴壁率。结果表明:将UC-MSCs和BMECs按照不同浓度比混合共培养后,细胞生长状态良好,无抑制作用;共培养后细胞贴壁率与时间呈正比,其中1∶2浓度组细胞贴壁率最高,在72 h时贴壁率为93.8%,而UC-MSCs单纯培养组和BMECs单纯培养组在72 h时的贴壁率分别为78.1%和79.6%。通过试验得出结论,UC-MSCs和BMECs混合共培养能够提高细胞贴壁率。

PGA组织工程支架材料的细胞贴壁性和全身毒性研究

目的可降解PGA材料作为一种组织工程支架材料,在组织工程产品中的应用越来越广泛。通过实验观察PGA材料的细胞相容性和是否引发动物的全身毒性反应。方法观察PGA材料的细胞相容性是将细胞在PGA材料上进行共培养,通过扫描电子显微镜观察细胞的贴壁状态,按照GB/T 16886.11-2001规定方法,对PGA材料的生理盐水浸提液进行小鼠急性毒性试验和大鼠亚慢性毒性试验。结果与结论L929细胞可以在可降解PGA纤维材料上正常贴壁;PGA材料的生理盐水浸提液对小鼠尾静脉注射50mL.kg-1后,未见急性毒性反应;可降解PGA纤维材料生理盐水浸提液对SD雄性大鼠尾静脉注射(10mL.kg-1),连续给药14天,结果样品各剂量组与对照组体重增长均正常,未发现临床征象等一般毒理学指标方面的异常,组织病理学检查未显示有相关的毒性靶器官或组织。

淋巴细胞贴壁抑制试验诊断风湿性心脏炎的特异性

目的 研究A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原在淋巴细胞贴壁抑制试验中诊断风湿性心脏炎的特异性。方法 用A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原和 1%植物血凝素 (PHA)作为刺激物 ,分别测定 38例健康对照组 ,30例风湿性心脏病活动组 ,2 4例风湿性心脏病静止组外周血淋巴细胞贴壁抑制百分率 (LAIP)。结果 在特异性菌膜抗原刺激下 ,风心活动组LAIP为 ( 34.47± 4.5 6 ) % ,显著高于风心静止组 ( 12 .5 0± 3 .73) %和对照组 ( 13 .5 6± 3 .31) % ,而后二者差异无统计学意义。在受PHA刺激后 ,风心活动组LAIP为 ( 8.95± 2 .5 2 ) % ,风心静止组 ( 6 .2 3± 1.6 1) % ,对照组 ( 7.5 1±3 16 ) % ,三者差异无显著性。结论 以链球菌菌膜为促凝刺激物的LAIP试验在判断风湿性心脏炎方面具有特异性 。

淋巴细胞贴壁试验诊断风湿性心脏病意义的探讨

目的 为寻找新的特异性和敏感性的指标 ,以探讨风湿热的活动性 ,从而提高风湿热和风心病的诊疗水平。方法 用A组乙型溶血链球菌特异性菌膜抗原和 1%植物血凝素 (PHA)作为刺激物 ,分别测定 38例健康对照组 ,30例风湿性心脏病风湿活动组 ,2 4例风湿性心脏病静止组的外周血淋巴细胞贴壁抑制百分率 (Lymphocyteadherencein hibitionpercent,LAIP)和促凝血活性 (Procoagulantactivity ,PCA)。结果 风心病活动组IAIP(34 47%± 4 5 6 % )显著高于风心静止组 (13 5 6 %± 3 31% )和健康对照组 (12 5 0 %±3 73% ) ,而后二者无统计学显著差异。风心活动组、风心静止组、健康对照组的淋巴细胞贴壁抑制指数同PCA相关系数分别为 0 85 94、0 8431、0 82 87,存在着正相关性 ,在统计学上无差异。PCA阳性率略高于LAIP ,但是二者无统计学差异。结论 LAIP在判断风湿活动方面有较大价值。

L929细胞无血清悬浮驯化及其在流产衣原体灭活疫苗中的应用研究

为通过悬浮细胞培养方法规模化生产流产衣原体抗原,采用逐步降血清悬浮驯化法使贴壁L929细胞逐步适应悬浮培养环境,最终获得了一株可无血清悬浮培养的L929细胞株。将流产衣原体接种于L929悬浮细胞上,研究不同的促感染试剂以提高收菌量,并选择出最佳的培养方法制备流产衣原体灭活疫苗。以25μL、50μL、100μL的剂量免疫Balb/c小鼠,攻毒后检测其免疫保护效果。结果显示,当该L929悬浮细胞初始接种密度为5×10^(5)/mL时,培养72 h后细胞浓度可达到约7×10^(6)/mL,细胞活力在95%以上;在细胞密度为6×10^(6)/mL,接菌量为5.5×10^(4) IFU/mL,加入脂质体2000的量为1.7μL/mL、放线菌酮浓度为0.4μg/mL时,菌量增殖倍数最大,48 h内约扩增了52倍。经流产衣原体悬浮培养细胞灭活疫苗免疫后,小鼠产生的抗体水平随免疫剂量的增加而提升;接种50μL、100μL疫苗组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、IFN-γ、IL-2的含量远高于接种25μL疫苗和注射PBS组的小鼠;对免疫后的小鼠进行攻毒,接种疫苗组小鼠的脾脏、十二指肠、子宫中的流产衣原体基因组含量远低于未接种疫苗组小鼠。注射PBS组及接种25μL疫苗组的小鼠子宫出现了不同程度的坏死及炎症,而其余两组小鼠的子宫无异常变化。结果表明,本试验成功驯化出1株L929悬浮培养细胞株,并且通过悬浮培养工艺制备的流产衣原体灭活疫苗免疫效果良好,接种50μL、100μL该灭活疫苗可以有效抑制流产衣原体的感染,该L929细胞全悬浮培养株的成功驯化为疫苗规模化生产提供了技术支持。

基膜黏连蛋白和Ⅳ型胶原对培养许旺细胞贴壁及增殖的作用

目的 了解基膜黏连蛋白和Ⅳ型胶原对体外培养条件下许旺细胞的贴壁及增殖作用的影响。 方法 用基膜黏连蛋白和Ⅳ型胶原包被培养板 ,以结合了相应抗体的培养板及包被Ⅰ型胶原和多聚赖氨酸的培养板为对照 ,将培养的许旺细胞以相同浓度加入各组培养板内。测定 2、6、2 4h细胞贴壁率 ,培养 72h进行3 H TdR掺入试验 ,双道液体闪烁计数器测定各组的放射性计数。 结果 基膜黏连蛋白和Ⅳ型胶原组早期贴壁率较Ⅰ型胶原和多聚赖氨酸组高 ,抗基膜黏连蛋白和抗Ⅳ型胶原组贴壁率较低。基膜黏连蛋白和Ⅳ型胶原组3 H TdR掺入量高于其它组。

组织工程支架材料聚乙醇酸的体外细胞贴壁性和降解性能研究

目的:选择可降解材料PGA作为研究对象,对其细胞贴壁性和体外及体内降解性能进行研究。方法:通过将L929细胞与支架材料共培养的方法对PGA支架材料的细胞贴壁性进行研究。设计试验计算出细胞在材料上的粘附率,并且通过扫描电子显微镜观察了细胞在材料表面的贴壁形态。在体外降解试验中,分别在去离子水和磷酸盐缓冲液中,在37℃和70℃的条件下对材料的降解性能进行观察。用大鼠皮下包埋试验对PGA在大鼠皮下包埋后1周、4周、8周、12周这4个时间点的降解表现进行了观察。结果:试验结果表明,共培养72 h后,扫描电镜观察到L929细胞在PGA材料上良好贴壁,细胞粘附率大于80%;降解试验表明PGA组织工程支架在动物体内12周内基本降解。结论:体外细胞贴壁性和降解试验的数据表明PGA组织工程支架符合组织工程产品支架材料的需求,是一种较好的组织工程支架材料。

贴壁培养细胞染色体原位制备方法

贴壁培养细胞染色体原位制备方法张进华，丁彦青，张亚历（广州第一军医大学病理学教研室，广州５１０５１５）染色体是细胞在准备分裂前，核中出现的独立深染小体，是细胞遗传的物质基础，是遗传信息的贮存库。染色体的数目和结构的畸变（或突变）与某些疾病的发生发展，...

人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34^+细胞体外扩增

从胎盘中分离培养人胎盘源贴壁细胞 (humanplacentaderivedadherentcells,hPDAC) ,研究其对脐血CD34+细胞体外扩增作用。以酶消化法自人胎盘组织中分离培养hPDAC ,并以流式细胞术对其进行鉴定。进一步 ,采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞 ,建立以hPDAC为滋养层的CD34+细胞体外扩增培养体系 ,并与无滋养层的液体培养体系相比 ,观察不同培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞百分率的影响。结果表明 ,人胎盘组织中可分离培养出hPDAC ,并证实其为混合性细胞群体 ,主要含有间充质细胞。以hPDAC为滋养层的共培养体系较无滋养层液体培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞均具有明显的扩增效应 ,其中以SCF +IL 3+IL 6 +FL +hPDAC组扩增效果最强 ,分别扩增了 ( 12 6 .0± 6 .7)倍 ,( 4 9.8± 1.7)倍和 ( 8.3± 1.6 5 )倍。上述结果提示 ,hPDAC具有体外支持造血作用 ,并提供了一与脐血CD34+细胞体外扩增相适应的新滋养层。

贴壁培养细胞台盼蓝拒染试验的方法学探讨

本工作旨在探讨贴壁培养细胞台盼蓝拒染试验的方法,为其合理应用提出建议。用正常培养及NaN_3作致死处理的人视网膜色素上皮细胞株-19,进行原位贴壁细胞和培养体系上悬液中细胞的台盼蓝拒染实验,并比较其原位法与计数板法所测活细胞率。与计数板法相似,随染液浓度增高或染色时间延长,原位台盼蓝拒染实验的活细胞率检测值逐渐增加。培养体系上悬液中脱落细胞的存活率显著低于贴壁的细胞,NaN_3处理使脱落细胞增加。因此,对于贴壁牢固的培养细胞,原位台盼蓝染色是检测活细胞率的实用方法。根据细胞从培养表面上消化下来的难易程度和脱落到培养上悬液中的数目多少,可选用原位染色法或/和计数板法台盼蓝拒染试验,从而检测贴壁培养细胞的总存活率。

人脐血贴壁细胞生物学特点的观察

为了探讨人脐血贴壁细胞分离培养的可行性 ,分离人脐血CD34+ 细胞进行Dexter培养 ,观察贴壁细胞的生物学特点。结果表明 :Dexter培养 9- 14天 (平均 11.2天 )时贴壁细胞集落开始形成 ,15 - 2 2天 (平均 19.6天 )时集落数量最多 ,培养 2 8天贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示 :非特异性酯酶染色 (NSE)、糖原染色 (PAS) 10 0 %为阳性 ,过氧化物酶染色 (POX)为阴性 ,碱性磷酸酶 (ALP) 2 8%为阳性。免疫组织化学染色显示 :CD10 6阳性达 96 % ,CD2 9阳性为 93% ,CD4 4阳性为 98% ,CD4 5为阴性 ,CD5 0 %阳性为 6 2 %。纤维粘连蛋白 (Fn) :92 %阳性 ;层粘连蛋白 (Ln) :74 %阳性 ;胶原Ⅳ :83%阳性。结论 :人脐血CD34+ 细胞群中存在造血基质细胞的前体细胞 ,人脐血贴壁细胞具有造血基质细胞的某些生物学特点。

细胞培养中珍贵贴壁细胞污染挽救方法的评价

目的细菌污染在细胞培养工作中在所难免,特别是珍稀细胞系受到细菌污染,污染后能否逆转,哪种方法可以挽救污染细胞既有效又对细胞生物学特性影响小,是本文探讨的目的。方法 分别采用抗生素除菌法、抗生素联合巨噬细胞吞噬法和裸鼠体内接种除菌法清除人喉鳞状细胞癌细胞系(laryngeal squamous carcinoma-1,LSC-1)的污染细菌,并对除菌效果做无菌检验,对细胞性状做免疫组织化学角蛋白染色和流式细胞仪DNA倍体分析,并与第3代细胞比较。结果 ①在3种敏感抗生素中,32mg/L的头孢哌酮/舒巴坦抗菌效果最好,细胞可传代3次;头孢哌酮/舒巴坦联合巨噬细胞吞噬法处理,细胞可传代5～6次,但抗生素撤离后上述2种方法培养的细胞液中均再次出现细菌,细胞逐渐死亡。裸鼠体内接种法的细胞形态最好,传代8次以上,冻存、复苏后仍能生长繁殖,并可在无抗生素培养基中生长,上清液细菌培养为阴性;②免疫组织化学角蛋白染色,抗生素法和抗生素联合巨噬细胞法所得细胞的角蛋白表达比例较低,而裸鼠体内接种法得到的细胞角蛋白表达较高,与该细胞系第3代比例基本相同;③DNA倍体分析,裸鼠体内接种法的细胞仍保持有二倍体和异倍体核型,与第3代细胞基本相同,而抗生素处理的细胞只保留有二倍体核型。结论 裸鼠体内接种除菌法能彻底清除喉癌细胞系中的污染细菌,并能保持肿瘤细胞的来源特征和增生活性,是细胞系去除污染细菌最为理想的方法。

脐血贴壁细胞体外培养的动态观察

用脐血MNC体外培养方法，观察脐血造血干细胞在细胞因子作用下形成的贴壁细胞，及其在形态学、组织化学和对造血于细胞生长增殖等方面的动态变化。结果显示：培养两周后的脐血贴壁生长细胞形态以上圆形、椭圆形内皮样细胞和巨噬细胞为主，膜分化抗原主要表达髓系抗原。脐血贴壁生长细胞形成后对造血干细胞的生长增殖具有良好支持作用。研究为实行造血基质细胞体外扩增应用于临床重建骨髓造血微环境提供了实验依据。

流式实验试剂的使用和操作对贴壁细胞的细胞周期结果的影响

目的:分析实验试剂的使用和操作对流式细胞术检测贴壁细胞的细胞周期结果的影响。方法:根据在染色液中是否添加RNA酶、收集贴壁细胞时是否收集培养液及操作时是否吹打的方式,将混悬细胞分为6组(每种处理方式分2组),用碘化丙啶(PI)试剂盒对MBA-MD-231细胞进行染色,采用FC-500流式细胞仪对贴壁细胞的细胞周期进行检测,观察染色液中是否添加RNA酶、是否收集培养液、或是否吹打对细胞流式信号分布图的影响。结果:染色液中添加RNA酶会造成流式信号分布图中细胞周期检测信号峰度变窄,各时期细胞比例发生变化;与仅收集贴壁细胞组相比,收集培养液时细胞碎片百分比略有增加(2.18%vs 1.24%),但对细胞周期检测结果没有影响;混悬细胞时过度吹打(≥30次)不影响细胞周期检测结果,但会造成细胞碎片百分比略有增加(2.31%vs1.24%)。结论:采用流式细胞术分析细胞周期时须添加RNA酶,实验操作时是否收集培养液和吹打细胞对细胞周期检测结果的影响不大。

培养板单层贴壁细胞的原位计数方法

本文报道一种使用网格对培养板单层贴壁细胞进行原位计数的方法。自行设计和制作了培养板底贴膜网格和4单元方格目镜网格。培养板底贴膜网格用于细胞计数区的定位,用目镜网格计数细胞。目镜网格单元方格的平均细胞计数除以方格的面积,再乘培养孔底面积,计算出一个孔的细胞总数。比较实验和统计学分析证明了这一方法的准确度、精密度和线性范围,而且本方法简便易行、低耗实用。数码显微照相技术的结合应用进一步增强了本计数方法的适用性。

人脐血贴壁层细胞对脐血造血细胞体外扩增的作用

实验于2004-10/2005-06在吉林省肿瘤防治研究所和吉林医药学院病原教研室完成。脐血采自长春市妇产医院健康产妇,知情同意,足月顺产,待胎儿娩出后,无菌经脐静脉穿刺取血,枸橼酸钠抗凝。Ficoll-paque淋巴细胞分层液(相对体积质量:1.077±0.22)密度梯度离心法分离出脐带血单个核细胞后,采用长期液体培养法培养脐带血贴壁层细胞,并与脐带血单个核细胞共同培养,观察细胞生长形态并通过流式细胞仪分析细胞周期。结果显示,脐带血贴壁层细胞与脐带血单个核细胞共培养7d后,与无贴壁层细胞培养的脐带血单个核细胞的细胞周期相比,贴壁层细胞能明显促进细胞的增殖,S+G2+M期细胞百分数明显增高,差异具有显著性意义[(42.7±1.1)%,(35.5±2.8)%,P<0.05]。脐血贴壁层细胞能促进脐血单个核细胞进入细胞周期,体外扩增后的脐血单个核细胞集落形成能力明显大于无贴壁细胞[(57.7±4.7)个/5×104,(40.3±5.1)个/5×104,P<0.01]。