小鼠骨髓间充质细胞转染PRDM16后向棕色脂肪样细胞转分化的初步观察

目的观察转染PRDM16后小鼠骨髓间充质细胞（BMSCs）向棕色脂肪样细胞的转分化.方法体外培养5周龄雄性C57BL/6小鼠的BMSCs,分为PRDM16转染组、阴性对照组和空白对照组.PRDM16转染组BMSCs中转染PRDM16腺病毒载体,阴性对照组转染等量的GFP-Adeno液,空白对照组中加入等量无血清的L-DMEM液.三组均应用成脂分化培养液培养,以促进BMSCs向脂肪细胞分化.通过RT-PCR法检测三组细胞中PRDM16和UCP-1的mRNA的表达情况.结果在PRDM16转染组中可以检测到PRDM16和UCP-1的mRNA的表达,而在阴性对照组和空白对照组中则未见二者的表达.结论通过在C57BL/6小鼠的BMSCs中转染PRDM16基因,可以使BMSCs成功表达PRDM16mRNA,并向脂肪细胞分化,同时能表达棕色脂肪细胞中的特征性标志物UCP-1的mRNA,说明转染PRDM16后,小鼠BMSCs能向棕色脂肪样细胞的转分化,为临床改善机体的胰岛素抵抗状态提供实验基础.本研究拟在体外培养的雄性C57BL/6小鼠BMSCs中转染PRDM16质粒,探讨其向棕色脂肪细胞转分化的可能性,为临床上改善肥胖患者的能量代谢提供一定的实验依据.

细胞转染条件的优化

通过对3种细胞转染方法(电穿孔法,磷酸钙法,阳离子性的脂质体法)的比较及优化,获得了理想的转染率,以进一步从细胞水平研究基因表达调控及小鼠ES细胞打靶.电压在350～450V,电穿孔法转染率与电压呈线性关系;用HEPES缓冲液能显著提高磷酸钙法转染率;低质量的DNA与细胞过长时间接触降低阳离子性脂质体法的转染效率.根据各种方法的特点选择和优化合适的细胞转染方法,可以提高哺乳动物细胞的转染率.

细胞转染技术在本科实验教学中的应用

结合本科生实验教学的特点,将细胞转染技术改造成适合本科生实验教学的内容。将含有线粒体信号肽和DsRed基因序列的载体MitoDsred转入HeLa细胞,在荧光显微镜下检测到发出红色荧光的DsRed定位于线粒体基质中。该实验可以单独开设,也可以与其他实验技术组合成基础性或综合性实验开设。通过该实验可以帮助学生掌握细胞转染及蛋白亚细胞定位的相关知识,提高学生的动手能力和综合素质。

奥曲肽对胰腺癌细胞转染SST 2后的作用

目的 将生长抑素二型受体 (somatostatinreceptortype 2 ,SST 2 )基因转染至胰腺癌细胞株PC 3细胞 ,探索奥曲肽对阳性表达SST 2的PC 3细胞凋亡影响。方法 采用脂质体 (Liposome)将SST 2基因转染至PC 3细胞 ,免疫组织化学染色检测其转染效果。MTT比色法及流式细胞术检测不同浓度梯度奥曲肽对PC 3细胞转染SST 2基因前后凋亡的影响。结果 胰腺癌细胞转染SST 2后 ,不同浓度奥曲肽 (0 .2 ,0 .4,0 .8μg/ml)杀伤已转染SST 2的PC 3细胞的能力较杀伤未转染SST 2的PC 3细胞的能力均有明显增强 (均P <0 .0 5 )。结论 生长抑素用于治疗PC 3细胞效果不佳可能与SST 2下调有关 ,转染SST 2后可增加奥曲肽对PC 3细胞的杀伤能力 ,这为临床利用SST 2基因转染加生长抑素类似物治疗胰腺癌提供了实验基础。

影响水牛胎儿成纤维细胞转染效率的因素

实验对电穿孔法和阳离子脂质体法转染水牛胎儿成纤维细胞的条件进行了系统摸索,获得了较好的DNA转染参数。电穿孔法转染时脉冲时间为15ms,电场强度为40～50V/m时,细胞的死亡率处于20%～50%之间,比较适合外源DNA转入水牛胎儿成纤维细胞。将脂质体与DNA的比例控制在8μL:2μg,可获得较高的转染率。相同培养条件下,脂质体法比电穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落,转染DNA的纯度和细胞的状态也明显影响脂质体法的转染效率。

阳离子脂质材料和聚乙二醇对脂质体细胞转染率及膜流动性的影响

目的 制备包封荧光素钠 (FS)的脂质体 ,考察阳离子脂质材料 (DC chol)和聚乙二醇 (PEG)对脂质体包封率、细胞转染率及膜流动性的影响。方法 以FS作为模型物质 ,制备并分离脂质体 ,测定脂质体包封率 ;通过观察荧光光谱的变化考察FS与脂质体膜之间的相互作用 ;以HepG2 2 .2 .15为细胞模型观察脂质体对FS细胞转染率的影响 ;通过荧光偏振技术考察阳离子脂质材料和PEG对脂质体膜流动性的影响。结果 阳离子脂质材料和PEG能提高脂质体包封率 ( 0 6 4 %～ 86 5 7% )、细胞转染率 ( 2 18%～ 4 8 4 6 % )及脂质体膜流动性 ,PEG分子质量的增大有利于包封率、转染率的提高 ,并增加脂质体膜的流动性。结论 在脂质体处方中加入阳离子脂质材料和高分子量的PEG有利于提高包封率。

大豆甾醇糖苷及两亲性聚乙二醇对阳离子脂质体细胞转染与膜各向异性的影响

目的 :考察不同脂质体材料对阳离子脂质体细胞转染率和脂质体膜流动性的影响。方法 :合成美国FDA认可应用于人体给药的阳离子材料 3β [N (N′ ,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β[N (N′,N′ dimethy laminoethane)carbamoyl]cholesterol,DC chol) ;以荧光素钠 (fluoresceinsodium ,SF)为荧光标记物 ,二棕榈酰磷脂酰胆碱 (dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺 (dioleoylphosphatidylethanolamine ,DOPE)和胆固醇 (cholesterol,ch)为辅佐膜材 ,分别制备DPPC/ch/DC chol阳离子脂质体、DOPE/ch/DC chol阳离子脂质体及大豆甾醇糖苷 (soybean derivedsterylglucoside ,SG)或聚乙二醇 -二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (polyethyleneglycol dis tearoylphosphatidylethanolamine ,PEG DSPE)表面修饰的阳离子脂质体 ,并制备DPPC/ch组成的中性脂质体。以HepG2 2 .2 .15为细胞模型观察不同脂质体处方对细胞转染率的影响 ;通过荧光偏振法考察不同脂质材料对脂质体膜流动性的影响。结果 :DC chol能显著增加脂质体对SF的包封率 (从 0 .6 4 %到的 74 .84 % )、细胞转染率 (从1.83%到 32 .2 9% )及脂质体膜的流动性。在阳离子脂质体处方中加入SG能显著提高阳离子脂质体的包封率 (从5 2 .6 0

新型细胞转染素—N^4-精胺胆固醇羰酰氨的合成

目的 合成新型阳离子脂质体 细胞转染素N4 精氨胆固醇羰酰氨 ,作为基因载体 ,用于肺部疾病的基因治疗。方法 用胆固醇羰酰氯为原料 ,与苄氧羰酰基保护的精氨选择性缩合 ,去保护 ,柱层析分离纯化。结果 以 2 5 .46%收率获得目标化合物 ,由波谱分析证实其结构。结论 建立选择性缩合和分离纯化方法 ,获得高纯度目标化合物 。

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。

广西巴马小型猪血清淀粉样P物质基因真核载体构建及细胞转染

血清淀粉样P物质(Serum Amyloid Pcomponent,SAP)是一种在进化上高度保守的血清糖蛋白,它可与各种类型的原纤维结合,在免疫应答和炎症反应等多种免疫疾病中发挥作用。以广西巴马小型猪肝组织总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出相应cDNA片段,连接到克隆载体pMD18-T上进行检测,测序结果为675 bp,与GenBank所提供相关序列同源性为100%,并成功构建pEGFP-N1-SAP重组真核表达载体,利用脂质体(Lipofectamine 2000)介导法将重组质粒导入到NIH-3T3细胞中培养,经转染24 h后,置于倒置荧光显微镜下观察,发现含有重组质粒的NIH-3T3细胞中表达出绿色荧光,为进一步研究SAP基因的功能特点及在试验动物相关疾病模型的应用提供条件。

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的 构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法 采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果 大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论 真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。

脊椎骨骨骺蛋白的细胞转染定位

目的 利用重组的脊椎骨骨骺蛋白 (Sedlin)的过表达来了解该蛋白质在细胞中的定位。方法 用间接免疫荧光的方法观察Sedlin在细胞中的定位。结果 荧光显微镜观察表明Sedlin分布于细胞核和细胞质中 ,极可能是以膜泡的形式存在。结论 实验结果为进一步了解Sedlin的功能提供了细胞学基础。

氯离子通道蛋白1的细胞转染定位

目的 利用重组的胞内氯离子通道蛋白CLIC 1蛋白的过表达来了解该蛋白质在细胞中的定位。方法 用免疫荧光的方法观察CLIC 1蛋白在细胞中的定位。结果 荧光显微镜观察表明CLIC 1蛋白虽然在细胞核中分布较为集中 ,在细胞质中也有相当的分布。结论 实验结果为进一步的了解CLIC

双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染

目的 :构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒 ,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果。 方法 :利用含HBVDNA(adrⅠ )的质粒 ,酶切出HBVDNA片段 ,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBVDNA的真核表达质粒 pcDNA3 ES HBV2 ;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区 ,再克隆入pcDNA3,构建成 pcDNA3 KN F1F2真核表达质粒 ;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株 ,进行G4 1 8筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBVDNA。 结果 :(1 )成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒 pcDNA3 KN F1F2及含双拷贝HBVDNA的真核表达质粒 pcDNA3 ES HBV2 ;(2 )对两质粒成功进行细胞转染后 ,测得第 3、6、1 4天细胞培养上清液中HBVDNA均高表达 ,两质粒之间差别不明显。 结论 :构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌 ;

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR-XL-TO-PO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达。结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。

整合素干扰载体的构建及细胞转染试验

应用RNA干扰方法,设计合成了整合素的2个不同干扰位点的shRNA及空白对照载体,转化E.coli DH5α菌株,扩大培养后提取质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞。RT-PCR方法检测显示,干扰载体在mRNA水平上的干扰效果明显。该干扰载体的构建及转染,为进一步研究整合素对猪细胞增殖特性及猪瘟病毒在细胞中的增殖作用奠定了基础。

大鼠共刺激分子B7cDNA的克隆和骨肉瘤细胞转染

目的 为了研究共刺激分子 B7增强针对大鼠骨肉瘤的特异性细胞免疫反应 ,首先需获得大鼠 B7分子的 c DNA克隆 .方法 应用反转录 PCR的方法 ,从大鼠脾细胞 m RNA中扩增特异性片段 .结果 经测序表明 ,所获得的 c DNA克隆与已经发表的 B7- 1和 B7- 2的 c DNA序列完全一致 ,并将其表达载体转染 UMR- 10 6细胞系 .结论 成功获得大鼠 B7共刺激分子的 c DNA克隆 ,其转染的 U MR- 10

细胞转染液与血清HLA-A、B抗原的检测

目前国内外对ＨＬＡ可溶性抗原检测尚未有统一标准，国内对其研究只是集中在个别常见ＨＬＡ型上进行测定。国外有报道指出，尽管能检测某一型膜抗原存在，但在其血清中不一定可以检测到该型可溶性ＨＬＡ抗原［１，２］。为此很有必要对尽可能多型的ＨＬＡ可溶性抗原进行检...

Schwann细胞转染Ha-Ras对 β_1 ,4-半乳糖基转移酶I,II,V表达的影响

目的 :研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha Ras后β1,4 半乳糖基转移酶I,II ,V(β 1,4 galactosyltransferaseI ,II ,V ;β 1,4 GalT I,II,V)表达变化。方法 :构建Ha Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞 ,将Ha Ras表达质粒转染到Schwann细胞中。采用NorthernBlot方法分析转染细胞中Ha Ras转染情况和转染后β 1,4 GalT I,II,V的表达变化。结果 :原代Schwann细胞转染持续激活型Ha Ras后 ,β 1,4 GalT I随转染时间延长而表达增高 ,而 β 1,4 GalT II及V的表达无变化。 结论 :β 1,4 GalT I随Schwann细胞转染时间Ha Ras延长而表达增高 ,提示原代细胞表面的 β 1,4 GalT I可能与Ha Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关。