IBD细胞适应毒对鸡法氏囊重与体重比值的影响

以IBDV—CM株10^4TCID50和IBDV—B87鸡胚中毒力活疫苗1羽份分别免疫14日龄非免疫健康三黄鸡．并于免疫后第3，7，10，14，21天，抽样称取每只鸡的体重和法氏囊重量，计算法氏囊重与体重的比值（B：B值）。试验结果表明：IBDV—CM细胞适应毒免疫鸡只后，免疫前期（7～10d）对雏鸡法氏囊有轻度损伤，免疫后期（免疫10d后）恢复较好，可抵抗IBD强毒攻击。

IBDV超强毒GX8/99株的细胞适应毒和鸡体传代毒的致病性和VP5基因的比较

传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Diseas Virus，IBDV）的超强毒株GX8／99经在鸡胚成纤维细胞（CEF）上连续盲传23代后，细胞适应毒株GXC23对鸡的致病性显著减弱，对4～6周龄SPF鸡的致死率从85％～90％减为0～5％。GXC23在96孔细胞培养板上经2次无限稀释法后得到3个克隆病毒。经SPF鸡回传20代后，相应的毒株GX-2820、GX-4820、GX-5820对SPF鸡的致死率仍维持在0～5％。序列比较表明，GX8／99在传代过程中，其细胞适应毒GXC23有8个碱基突变，其中5个碱基突变导致了氨基酸改变。bp#2T→c突变，导致传代毒ORF中的起始编码子后移了4个氨基酸。而3个克隆化病毒回鸡20代后致病性不变，这几个位点也保持不变，且与3个疫苗株完全一致。进一步分析表明，有4个超强毒株和4个强毒株的VP5基因的5个位点与GX8／99原始毒相同，而另3个超强毒及6个强毒株与细胞适应毒GXC23一致。这些结果表明，超强毒GX8／99在细胞传代过程中VP5基因上5个氨基酸的变异主要与适应细胞培养相关而与致病性无关。

IBDV超强毒GX8/99株细胞适应毒及其鸡体回传毒的致病性、免疫原性比较

传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)的超强毒株GX8/99经在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代22代后,细胞适应毒株GXC23对鸡的致病性显著减弱,对4～6周龄SPF鸡的致死率从85%～90%,减为0～5%。将GXC23在96孔细胞培养板上经两次无限稀释法得到3个克隆病毒。在SPF鸡回传20代后,相应的毒株GX-2B20、GX-4B20、GX-5B20,对SPF鸡的致死率仍维持在0～5%。回传23代后,GX-2B23,GX-4B23免疫2周龄SPF鸡,3周后虽然能引起法氏囊一定程度的萎缩及点状出血,法氏囊髓质区淋巴细胞坏死和变性,而且,仍表现出明显的免疫抑制性,都能造成新城疫,禽流感(H9-和H5-)疫苗抗体水平的显著降低。但是二者却都可以诱导机体产生很高的抗体水平,可抵抗超强毒GX8/99的人工感染,保护率可达100%。

鸡IBD细胞适应毒引起鸡免疫器官病理学变化研究

以IBDVCM株104TCID50和IBD-B87鸡胚中毒力活疫苗1羽份,分别免疫14日龄非免疫健康三黄鸡。免疫后第3,7,10,14,21,24天剖杀鸡只,取其法氏囊、胸腺、脾脏进行病理检查。结果表明,IBDVCM株免疫雏鸡后,前期对法氏囊稍有损伤,免疫后期恢复较好。

鹅细小病毒细胞适应株结构基因序列分析

为了研究鹅细小病毒（GPV）YAN98分离株在鹅胚成纤维细胞（GEF细胞）中的适应及变异情况,试验将YAN98毒株接种至GEF细胞中并连续传代至F21代,利用分段PCR法扩增F21代细胞适应毒和亲本病毒F0的结构基因序列,通过对测定序列进行剪辑、拼接,将F21代病毒结构基因序列与亲本病毒序列进行比对,并推导氨基酸差异位点,分析遗传变异性。结果表明,该病毒分离株已适应GEF细胞,并在72-96 h产生明显的细胞病变,其F21代病毒效价为105.5TCID50。F21代病毒与亲本病毒F0代结构基因中存在11个核苷酸差异,推导的氨基酸序列与亲本病毒氨基酸序列比对差异不显著,存在5个差异位点。

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。

Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究

将“北京”及“CTN”两株中国分离的狂犬病病毒毒株适应于Vero细胞,病毒滴度可达10^(7.5)LD_(50)/ml。应用Veto细胞微载体反应器系统培养病毒,经丙内酯灭活,超滤浓缩制备的疫苗,其效力试验(NIH法)结果优于现行原代地鼠肾细胞培养疫苗。

超强毒IBDV GX8/99株4株克隆化毒F20代免疫效果分析

本研究将以vvIBDV GX8/99株4株克隆化细胞毒为研究对象,通过鸡胚成纤维细胞连传至20代,得到4株克隆化毒F20代:GX-IBDVE10C25CL1-20、GX-IBDVE10C25CL2-20、GX-IBDVE10C25CL4-20、GX-IBDVE10C25CL5-20。分别提取RNA,通过Nested-PCR、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,从而摸索出了vvIBDV GX8/99株四株克隆株在细胞传代过程中VP2核苷酸序列和推导出的氨基酸序列的变化规律。与原始囊毒和D78疫苗毒相比,4个细胞适应毒克隆株F20 VP2高变区的约145个氨基酸中,有12个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致。实验表明VP2高变区大多数氨基酸的变异与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切。将4株克隆毒株的20代细胞毒免疫SPF鸡,40日龄进行攻毒实验,免疫效果明显,保护率几乎达到100%,二免后第14 d左右抗体浓度达到高峰。从抗体水平和病理组织学变化看,4株克隆化毒F20代中GX-IBDVE10C25CL4-20株免疫效果稳定,病理变化不明显,有望成为理想的疫苗株,为控制vvIBDV的感染提供一条新的途径。

用CaG株毒种制备精制狂犬病疫苗的研究

通过对狂犬病毒aG株在金黄地鼠肾细胞上传代培养 ,获得一种新型狂犬病毒毒株 ,即地鼠肾细胞适应株(CaG株 ) [1] 。由于该毒种具有生产方法简单 ,成本低廉 ,且外源因子污染机率小等优点 ,因此试用该毒种生产精制狂犬病疫苗。在相同条件下 ,分别用豚鼠脑毒种和细胞毒种各生产 3批病毒原液 ,经相同纯化工艺制备成精制狂犬病疫苗。经初步检定用细胞毒种制备的疫苗安全性良好 。

鸡新城疫和传染性法氏囊病二联灭活疫苗的制备及检验

采用NDV La Sota株毒种接种鸡胚制备NDV抗原液,IBDV BJQ902细胞适应毒接种鸡胚成纤维细胞制备IBDV抗原液,用甲醛溶液灭活后,按一定比例混合,加入油佐剂乳化制成ND-IBD二联灭活疫苗。共制备了3批疫苗,对其进行各项检验。结果表明,疫苗无菌;外观为乳白色均匀乳剂,剂型为W/O/W型,黏度为1.0 s^1.2 s,粒度均匀,99%以上为1μm,个别为2μm^3μm,3 500 r/min离心15 min,管底出水在0.5 mm以下;疫苗安全性检验,接种24日龄~28日龄SPF鸡后,观察14 d,均无任何局部及全身不良反应;疫苗ND部分效检,免疫接种3周后ND HI抗体平均滴度为3.0~3.6 log2,攻毒后保护率分别为9/10、9/10和10/10,IBD部分效检免疫接种后4周,中和抗体滴度分别20 171、24 578及26 616,攻毒保护率均为100%(10/10)。结果证实3批疫苗均符合要求。

超强毒IBDV GX8/99株不同传代毒致病性与VP5基因的关系分析

将vvIBDV GX8/99株原代毒、鸡胚毒、克隆化毒、回传SPF鸡10代次毒及克隆化细胞传20代次毒分别测定ELD50,以相同的ELD50病毒量分别接种SPF鸡,从而观察vvIBDV GX8/99株在传代过程中致病性的变化规律。同时分别提取病毒RNA,通过RT-PCR、PCR扩增、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,对IBDV GX8/99株的24株不同传代毒的VP5基因进行比较,发现其同源性在94%～100%,并且有15个易发生变异的位点,其中位点bp#2、#8、#52、#145、#232、#272、#310、#364、#385、#409的碱基变异引起了相应氨基酸的改变,而位点bp#18、#285、#331、#354、#397的碱基变异没有引起相应氨基酸的变化。通过比较分析,可以看到在致死率由原代毒的86.7%降为GXE10的43.0%时VP5基因的核苷酸有4个位点发生了变异,致死率由GXE10的43.0%降为GXC23的3.3%时VP5基因的核苷酸有10个位点发生了变异;而将GXC23克隆化后的4株毒株致病性变化不大,并且仅在GXCL1-1的#8位点,GXCL2-1和GXCL4-1的#364位点发生变异;将4株克隆化毒株回鸡传10代后的致死率有一定程度的回升,且有2个位点发生变异;4株克隆化毒株在细胞上连续传20代后其致死率都降为0.0%,并且克隆株5没有发生核苷酸变异而克隆株1,2,4也仅有1个核苷酸位点发生变异。由此推论vvIBDVGX 8/99株的致病性与VP5基因某些氨基酸的变异有一定的关系,更可能与病毒对细胞的亲嗜性关系密切;这为探明vvIBDV毒力改变的分子基础,从而解释自然界中vvIBDV出现和致弱的原因提供了佐证。