鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应病毒株的培育及序列分析

为培育高滴度的鹅细小病毒(GPV)细胞适应病毒株,本研究将原代鹅胚成纤维细胞(GEF)进行连续传代培养,并传至31代次,传代的GEF具有典型的成纤维细胞形态,培养48 h后形成单层细胞。选取不同代次的GEF接种GPV YN分离株,并在GEF中连续传代至F20代,病毒滴度由102.5TCID50/0.1 m L达到106.16TCID50/0.1 m L,表明GPV已适应GEF,并在感染GEF后的72 h产生明显细胞病变。对细胞适应毒F20和亲本病毒F0代进行基因序列比对结果显示,F20与F0存在133个核苷酸差异位点,主要集中在5'和3'非编码区。氨基酸序列共出现22个变异位点,主要集中在VP3蛋白中。这些变异与病毒对细胞培养的适应过程有关,其机理有待进一步研究。

细胞传代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性变化的研究

将禽偏肺病毒(aMPV)JC株在Vero细胞上传代传至第50代时,细胞适应毒株毒价为105.6TCID50/m L;雏鸡致病性试验结果显示,aMPV JC株细胞传代第50代与亲本毒F0相比感染雏鸡发病率降低,病理变化减轻,表明第F50细胞适应毒的毒力减弱。

一株Vero细胞适应的柯萨奇病毒A组10型毒株遗传稳定性研究

目的探讨一株手足口病相关柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株R6-19/XY/CHN/2017在Vero细胞中的适应性,及其连续传代的遗传稳定性。方法对R6-19/XY/CHN/2017毒株在Vero细胞上进行连续适应传代培养后,对适应前病毒及适应后的第1、5、10、15代次毒株的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒感染性滴度、全基因组核苷酸序列及氨基酸序列等进行比较分析。结果该毒株能较好地在Vero细胞上适应,不同代次的感染性滴度在7.85 lgCCID50/ml^8.17 lgCCID50/ml。与适应前毒株比较,其5′UTR及编码区共有7个碱基发生改变,VP4和VP1编码区分别有1、3个氨基酸发生改变;而适应后病毒各代次在CPE、病毒感染力特点等无明显区别,且各代次全基因核酸序列中,只有第15代的VP1蛋白编码区发生一个碱基突变。结论 CV-A10株R6-19/XY/CHN/2017能在Vero细胞较好地适应,并具有良好的遗传稳定性,这将为后续CV-A10疫苗的研发和相关机制研究提供参考。

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL^(TM) VERO、Virus Pro ^(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。