体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞

目的探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞(UMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的方法。方法用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶和0.25%胰蛋白酶消化法原代分离培养UMC细胞,用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞,镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果脐带组织分离培养第3天,有少量UMC贴壁生长,细胞膜周围有折光性,形态类似于成纤维细胞;皮肤组织块贴壁培养第7天,有HSF爬出,呈长梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长,UMC和HSF数量逐渐增多,细胞生长状态良好。结论应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培养出UMC和HSF。

携带GFP基因逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞

目的应用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞,为细胞重编程实验提供有效基因转移载体。方法利用酶消化法在体外分离培养脐带基质间充质细胞。应用磷酸钙法将GFP基因转染到293T细胞内,包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。收集病毒上清液感染脐带基质间充质细胞,应用倒置荧光显微镜观察逆转录病毒感染脐带基质间充质细胞情况。结果体外分离培养出脐带基质间充质细胞;293T细胞包装生产携带GFP基因逆转录病毒;包装生产后的逆转录病毒成功地感染脐带基质间充质细胞。结论逆转录病毒可作为有效载体将外源性基因转染入脐带基质间充质细胞内,并且细胞能够稳定表达被导入的外源性基因。

利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞编程为多潜能干细胞

目的:探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞(UMC)编程为多潜能干细胞(iPS)的可能性。方法:原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染UMC细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化。对编程后细胞进行碱性磷酸酶(AP)染色、检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验。结果:获得原代UMC细胞,细胞被编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,外源编程基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc表达沉默,细胞体内分化为畸胎瘤。结论:利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因能将UMC细胞编程为iPS细胞。

Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因编程脐带基质间充质细胞

目的探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞(UMC)编程为多潜能干细胞(iPS)。方法原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化。对编程后细胞进行碱性磷酸酶(AP)染色、检测细胞内源多能基因表达量和体内分化畸胎瘤实验。结果原代获得UMC细胞,被编程细胞形态类似于胚胎干细胞,AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,体内分化为畸胎瘤。结论利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将UMC细胞编程为iPS细胞。

人角膜基质间充质干细胞的分离培养及表型鉴定

目的建立人角膜基质间充质干细胞(HCS-MSC)体外分离培养、传代和鉴定等方法。方法无菌条件下,取眼科临床角膜移植术后剩余的供体角膜缘组织,去除上皮和内皮组织,将基质组织切成1mm×2mm的组织块,采用无动物源性血清的间充质干细胞培养液进行组织块贴壁法培养,倒置显微镜下动态观察细胞的生长形态及贴壁状态,将传代培养后的第三代细胞采用流式细胞分析法进行表型鉴定,液氮冷冻保存。结果采用人角膜缘基质组织块贴壁法培养,于培养后第7天开始向周围呈放射状长出细胞,14天左右长满培养皿,细胞形态呈均一梭形;传代培养后生长快速,于2~4天达90%融合;连续传代3次,其生长特性和形态不变,CD90,CD29和CD105阳性率>95%,CD34和CD-HLA-dr阳性率<3%。结论采用人角膜缘基质组织可分离培养出间充质干细胞,为角膜组织修复、重建及对抗免疫排斥反应等奠定基础。

人角膜基质间充质干细胞外泌体的分离制备及鉴定

目的制备人角膜基质间充质干细胞(human corneal stromal mesenchymal stem cells,HC-MSCs)外泌体并进行生物学鉴定。方法采用组织块培养技术获得HC-MSCs,利用超速离心法从HC-MSCs培养上清中分离制备外泌体,通过蛋白免疫印迹、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法进行鉴定。结果分离的纳米囊泡表达外泌体特异性标志蛋白CD63,CD81和TSG101,在透射电子显微镜下可见其呈圆形、卵圆形和杯盘状囊泡,直经113.3 nm。结论从HCMSCs培养上清中可分离出具有典型结构及特征的外泌体,为HC-MSCs外泌体的作用机制及其在眼科的转化应用研究奠定坚实的基础。

细胞凋亡与椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变被认为是腰背痛的主要原因,细胞死亡导致椎间盘细胞减少,细胞间基质代谢平衡被打破,基质降解增加,主导了椎间盘退变的过程。椎间盘退变中细胞死亡成为了研究焦点。本文通过分析总结椎间盘退变的相关文献,就椎间盘退变的诱导因素,椎间盘退变中细胞凋亡信号的转导进行综述。

莪术对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的探讨中药莪术对大鼠单侧输尿管梗阻动物模型(UUO)的影响及其可能机制。方法利用单侧输尿管梗阻的方法(UUO)建立大鼠肾间质纤维化的动物模型,并用中药莪术对其治疗,设为中药治疗组,以氯沙坦为西药对照组,采用免疫组化和原位杂交方法观察细胞外基质IV型胶元、α-SMA和TGF-β、NF-Kb、PAI-1的表达。应用医学病理图像分析系统对阳性面积进行统计学分析。结果动物实验莪术治疗组与模型组比较,免疫组化、原位杂交各检测指标统计学上有显著差异(P<0.05);莪术组TGF-β、NF-Kb、α-SMA、COL-Ⅳ、PAI-1mRNA表达明显低于模型组,各项检测结果也有显著差异(P<0.05)。莪术组肾间质原位杂交检测阳性面积表达明显低于模型组,有显著差异。结论莪术可能通过抑制与纤维化关系最密切的细胞因子如TGFβ1,核因子NF-Kb来抑制成纤维细胞活性,阻止MyoFb的出现,以及通过下调PAI-1来调节纤溶系统平衡,抑制细胞外基质合成,促进其降解等机制延缓肾间质纤维化。

Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因重编程人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因能否将人皮肤成纤维细胞(HSF)编程为诱导性多潜能干细胞(iPS)。方法①利用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞。②包装生产携带Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因的逆转录病毒上清液感染HSF细胞。③病毒感染后HSF细胞培养,镜下观察HSF细胞形态学变化。④应用细胞碱性磷酸酶(AP)染色检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验对细胞生物学特性进行鉴定。结果原代HSF细胞编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,细胞体内可分化为畸胎瘤。结论利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将HSF细胞编程为iPS细胞。

银屑病患者血清TNF-α、HA、LN浓度变化与细胞粘附分子的关系

目的 :探讨细胞因子 (TNF α)、细胞间基质成分 (HA、LN)与细胞粘附分子 (CD44 )在银屑病时的关系及致病作用。方法 :采用放射免疫分析法及流式细胞术检测了 35例银屑病和 30例健康人血清TNF α、HA、LN含量及外周血单核细胞CD44阳性细胞数。结果 :银屑病患者血清TNF α、HA及LN浓度均明显高于对照组 ,差异显著 (P <0 .0 1)。CD44阳性率亦显著增高 ,与对照组比较差异十分显著 (t=17.99;P <0 .0 1) ,银屑病患者CD44表达上调与HA浓度增高呈正相关 ,HA与TNF亦呈正相关。结论 :CD44作为透明质酸受体与TNF。

透明质酸与口腔颌面部肿瘤

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种高分子葡萄糖胺聚糖,是构成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞间基质(intercellular matrix,ICM)的主要成分.HA在人体中发挥着重要的生理作用:①HA为关节滑液的主要成分,赋于滑液良好的粘弹性.②对细胞具有保护作用.③促进伤口愈合,减小瘢痕.④HA可与细胞膜表面HA结合蛋白(HA-binding protein,HABP)(如CD44)特异性结合,在组织生成,创伤修复,肿瘤扩散以及免疫过程中均发挥作用.目前研究表明,HA对肿瘤血管的生成、肿瘤侵袭转移等方面具有重要调节作用.本文就HA在肿瘤组织及体液中的表达作一综述.

p,p′-DDT对乳腺癌细胞MCF-7黏附能力及黏附分子的影响

目的探讨有机氯残留物有效成分p,p′-DDT对乳腺癌细胞MCF-7黏附能力及黏附分子的影响。方法将10^(-7)mol/L的p,p′-DDT作用于MCF-7 48h后,分别采用细胞聚集试验和结晶紫染色法分析其对MCF-7细胞间黏附率和细胞与基质间黏附率的影响,并采用RT-q PCR法和Western blot法检测MCF-7中钙黏附蛋白E(E-cadherin)和CD29 mRNA和蛋白表达水平。结果 10^(-7)mol/L的p,p′-DDT作用MCF-7 48h后,MCF-7细胞间黏附率明显降低,细胞与基质间黏附率明显升高;同时下调了E-cadherin mRNA和蛋白表达水平,上调了CD29 mRNA和蛋白表达水平。结论 p,p′-DDT具有降低MCF-7细胞间黏附并提高细胞与基质黏附的作用。p,p′-DDT可能通过改变黏附关键因子E-cadherin和CD29的表达来影响细胞黏附,进而促进肿瘤细胞的侵袭、转移。

五氯联苯PCB118对人肝癌细胞BEL-7402细胞黏附的影响

目的探讨五氯联苯PCB118对人肝癌细胞细胞-基质间和细胞-细胞间黏附的影响和机制。方法人肝癌细胞BEL-7402用PCB118 0.1,1.0和10.0 nmol·L^(-1)分别处理4和6 d后,采用细胞-基质间黏附实验检测细胞-基质间黏附,细胞聚集实验检测细胞间黏附,实时荧光定量PCR法和Western蛋白印迹法检测细胞黏附关键因子CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的表达。结果与细胞对照组相比,人肝癌细胞BEL-7402在PCB118 0.1,1.0和10.0 nmol·L^(-1)处理6 d后,细胞-基质间黏附能力明显提高(P<0.05),细胞-细胞间黏附明显降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,PCB118明显提高黏附关键因子CD29和N-钙黏着蛋白m RNA水平(P<0.05),显著降低E-钙黏着蛋白m RNA水平(P<0.05)。Western蛋白印迹结果表明,PCB118处理后,CD29和N-钙黏着蛋白的蛋白表达显著升高(P<0.01),E-钙黏着蛋白的蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论 PCB118影响肝癌细胞黏附并改变黏附因子CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的表达,这可能与PCB118促进肝癌的发展有关。

糖蛋白抗肿瘤研究进展

糖蛋白是由一个或多个寡糖链通过不同连接方式与蛋白质部分的多肽骨架共价相连而成。在生物体内的糖蛋白种类繁多,广泛存在于动物、植物和某些微生物中,在生物体内它以不同形式存在而发挥作用,是细胞膜、细胞间基质、血浆、粘液、激素等的重要构成成分。糖蛋白中糖链维持蛋白质结构稳定,抵抗蛋白酶水解,参与多肽链在内质网的折叠启动及防止抗体的识别。糖蛋白具有调解和开关激素功能、胞内转运功能,还具有保护与促进物质吸收、参与血液凝固、

“双相”组织工程软骨修复兔关节骨软骨缺损

目的探讨“双相”异体骨基质明胶(bonematrixgelatin,BMG)作为组织工程软骨载体,与同体骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)结合,构建组织工程软骨修复兔关节骨软骨缺损的效果。方法4月龄新西兰兔32只,雌雄不限,体重2～3kg。1体外实验:取5只新西兰兔,处死后取髂骨和四肢骨,制备一侧松质骨,一侧皮质骨的“双相”异体BMG载体,扫描电镜观察。另取新西兰兔18只,抽取骨髓,分离MSCs并诱导成软骨分化;将诱导而来的软骨前体细胞与“双相”BMG载体复合构建组织工程软骨,分别于1、3和5周取材行Masson、PAS染色和扫描电镜观察。2体内实验:将抽取骨髓的18只及余下的9只新西兰兔制成双侧股骨内髁骨软骨缺损模型,将前期制备的组织工程软骨同体植入18只兔的右股骨内髁骨软骨缺损(A组),左侧缺损移植异体BMG(B组),其余9只双侧软骨缺损未予处理作为空白对照(C组),分别于术后1、3和6个月取材,行大体、组织学和型胶原mRNA原位杂交观察,改良Wakitani法评分,比较各组修复效果差异。结果1体外实验:“双相”BMG松质骨面孔隙大小100～800μm,细胞于其中增生,形成富含细胞的软骨层;皮质骨面孔隙大小10～40μm,细胞层状覆盖于其表面,可作为起支撑作用的软骨下骨。2体内实验:A组术后1个月即可重建关节骨软骨缺损;修复软骨在观察期内逐渐变薄,但在6个月内始终保持关节面及软骨下骨结构完整。B、C组未能修复缺损,缺损周边软骨磨损加剧。改良Wakitani评分显示A组在3个时间点的各项评分结果,除6个月软骨厚度外,其它指标均优于B、C组,且差异有统计学意义(P<0.01)。型胶原mRNA原位杂交显示,A组缺损区修复组织中细胞阳性染色率明显高于B、C组,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论“双相”异体BMG可作为组织工程软骨载体材料,其结合自体MSCs诱导的软骨前体细胞制备的组织工程软骨,可修复兔关节软骨和软骨下骨。

扩张型心肌病患者左心室扭转与重构的关系

心脏重构是由于心肌细胞或细胞间基质成分在特定刺激（如心肌受损、压力及容量负荷增大等）下出现的心肌僵硬,心肌形态、大小及功能的相关改变。扩张型心肌病（dilated cardio myopathy,DCM）临床表现为反复发作的充血性心力衰竭,以心肌纤维变性、心腔扩大、心壁变薄、心脏收缩功能降低为特点,其重构是全心腔的扩张,以左心室最为显著,最终由类椭圆形发展为球形。

转化生长因子β3与创面愈合及瘢痕形成关系研究进展

TGF—β是指能调节细胞增殖、分化、细胞间基质蛋白表达的一类多功能细胞生长因子，其特征性表现是能可逆地抑制多种细胞的生长增殖。TGF-β至少有6种亚型，各亚型之间有64％～82％的同源性。目前在哺乳类动物中检测到TGF-β1、TGF-β2、TGF—β3种亚型，由于高度保守且对受体的亲和力各不相同，

右额软骨黏液样纤维瘤一例

患儿 男，6岁。发现右额部肿块3个月就诊，肿块初起约黄豆大小，逐渐增大，不伴有局部疼痛、发热、头痛等不适。检查：右额部肿块约1.5 cm×1.5 cm大小，凸出于表面，表面肤色正常，触之质地韧、无压痛，基底部固定、不活动。患儿既往体健，无头部外伤史。头部X线片示右额骨类圆形缺损；头颅CT示右额部软组织密度肿物伴右额骨缺损（图1）。术中见肿块位于骨膜下方，浸润颅骨，局部颅骨呈类圆形凸起，色泽发红，质地硬（图2）。于肿块旁钻一骨孔，从该骨孔出发环形切除肿块及相邻颅骨，肿块下方硬脑膜完整。病理表现：大体样本示局部骨皮质菲薄，病变组织呈灰白色、鱼肉样、质地韧（图3）。镜下观察：肿瘤细胞呈星形、梭形、圆形，呈不完全的分叶状结构，小叶中央有淡蓝色黏液，周围细胞较丰富，细胞间基质呈淡蓝色（图4）。免疫组化染色示：Vimentin（＋），S-100（-），CD34（血管内皮＋），FxⅢ（-）。患儿术后随访2年，肿物未复发。