下调HMGB2表达对肝癌LM3细胞上皮-间质转化的抑制作用及其AKT/mTOR信号通路机制

目的:探讨下调肝癌细胞中高迁移率族框蛋白2 (HMGB2)表达对肝癌细胞生物学行为及上皮-间质转化(EMT)进程的影响,并阐明其作用机制。方法:对数生长期的人肝癌LM3细胞分为阴性对照组和HMGB2 RNA干扰组(HMGB2 siRNA组),分别以Lipofectamin 2000为载体转染无关序列的RNA寡核苷酸(RNA oligo)和敲除HMGB2序列的RNA oligo。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测2组细胞中HMGB2 mRNA和蛋白表达水平,分别采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测2组细胞的迁移和侵袭能力,采用Western blotting法检测2组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、 N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达水平。结果:与阴性对照组比较,HMGB2 siRNA组细胞中HMGB2 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),HMGB2 siRNA组细胞划痕愈合率明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin、Vimentin、mTOR、AKT和磷酸化AKT (p-AKT)蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:下调HMGB2的表达可降低肝癌LM3细胞迁移和侵袭能力并抑制EMT,其作用机制可能与参与调节AKT/mTOR通路相关蛋白表达有关。

乌司他丁调节CCL2-CCR2信号轴对胃癌细胞上皮-间质转化和免疫逃逸的影响分析

目的:探讨乌司他丁(UTI)调节CC趋化因子配体2(CCL2)-C-C趋化因子受体2(CCR2)信号轴对胃癌(GC)细胞上皮-间质转化(EMT)和免疫逃逸的影响。方法:qRT-PCR、Western blot分别检测GC组织/细胞中CCL2、CCR2 mRNA及蛋白表达水平;以不同浓度的UTI(0、100、200、400、800 U/ml)干预细胞,MTT法检测细胞增殖情况;将AGS细胞分为control组、UTI组、pcDNA组、pcDNA-CCL2组,平板克隆和Transwell小室分别检测细胞增殖、迁移、侵袭。AGS细胞和CD8+T细胞共培养后,将CD8+T分为T细胞组、共培养组、UTI组、pcDNA组、pcDNA-CCL2组,流式细胞仪检测CD8+T细胞凋亡,ELISA检测CD8+T细胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平;Western blot检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、程序性死亡配体1(PD-L1)及CCL2-CCR2信号通路蛋白表达。结果:在GC组织/细胞中,CCL2、CCR2蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05);UTI显著抑制AGS细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT,降低AGS细胞中MMP-2、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达,升高E-cadherin蛋白表达(P<0.05);过表达CCL2可逆转UTI对细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的抑制作用;与T细胞组比较,共培养组CD8+T细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低,细胞凋亡率升高(P<0.05);与共培养组比较,UTI组CD8+T细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与pcDNA组比较,pcDNA-CCL2组CD8+T细胞上述指标变化均显著逆转(P<0.05)。结论:UTI可能通过抑制CCL2-CCR2信号通路抑制AGS细胞的EMT和免疫逃逸。

桃叶珊瑚苷调节RhoA/ROCK信号通路对胶质母细胞瘤细胞活力和上皮间质转化的影响

[目的]研究桃叶珊瑚苷(AU)对胶质母细胞瘤(GBM)细胞活力和上皮间质转化(EMT)的影响,并对其作用机制进行探讨。[方法]将U87细胞随机分为对照组、AU低浓度组、AU中浓度组、AU高浓度组、Y-27632组、AU高浓度+Y-27632组。细胞计数器试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)1、ROCK2表达。构建GBM裸鼠模型,随机分为裸鼠对照组、AU组、Y-27632组、AU+Y-27632组,测量肿瘤质量与体积,免疫组化法检测移植瘤组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。[结果]GBM细胞活力随着AU浓度的升高而逐渐降低(P<0.05),选择U87作为后续实验细胞,选择10、25、50μmol/L浓度作为AU后续实验浓度。与对照组比较,AU低、中、高浓度组和Y-27632组细胞活力、迁移和侵袭细胞数、MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、RhoA、ROCK1、ROCK2表达显著下降,凋亡率、E-cadherin表达显著升高(P<0.05),其中高浓度AU和Y-27632组共同处理的细胞变化更显著(P<0.05)。AU和Y-27632均能抑制移植瘤质量和体积,降低RhoA/ROCK信号通路蛋白表达(P<0.05)。[结论]AU能抑制GBM细胞活力、迁移侵袭和EMT,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

KRT6A介导Wnt/β-catenin信号通路调节上皮-间质转化促进非小细胞肺癌A549细胞抗辐射

目的 探讨KRT6A对非小细胞肺癌A549细胞抗辐射的促进作用,并阐明其作用机制。方法 诱导并建立抗辐射A549(A549-RR)细胞,通过CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术验证细胞构建成功。Western blotting检测A549和A549-RR细胞中KRT6A表达情况。将A549-RR细胞分为敲减对照组(sh-NC组)和敲减KRT6A组(sh-KRT6A组),Western blotting检测KRT6A、上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug)以及β-catenin的表达;采用CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。将A549-RR细胞分为sh-NC组、sh-KRT6A组、敲减KRT6A和过表达对照(shKRT6A+ov-NC组)以及敲减KRT6A和过表达β-catenin (sh-KRT6A+ov-β-catenin组),Western blotting检测β-catenin以及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达;采用CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。结果 成功建立了A549-RR细胞,A549-RR细胞中KRT6A表达上调。敲减KRT6A降低A549-RR细胞增殖活性和克隆形成能力,增加细胞凋亡率,上调E-cadherin蛋白表达并下调N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和β-catenin蛋白表达;过表达β-catenin可逆转此作用。结论 KRT6A在A549-RR细胞中表达上调,敲减KRT6A可降低A549-RR细胞的抗辐射能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路诱导的EMT有关。

白细胞介素-6对胰腺癌小鼠癌组织的细胞增殖及上皮间质转化的影响

目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)在胰腺癌裸鼠模型癌组织增殖与上皮间质化中的作用,并分析其分子机制。方法 将18只成功构建胰腺癌细胞荷瘤的BALB/c裸鼠模型随机分为模型对照组、IL-6过表达组和免疫球蛋白G(IgG)抗体组,每组6只。模型对照组于肿瘤部位注射生理盐水进行干预,IL-6过表达组于肿瘤部位注射IL-6过表达质粒进行干预,IgG抗体组予肿瘤部位注射IgG抗体进行干预。3组均于末次给药24 h后处死小鼠,并收集胰腺肿瘤组织。对各组肿瘤组织进行离体称重并计算抑瘤率。通过苏木精-伊红(HE)染色观察胰腺组织的病理学改变。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组裸鼠肿瘤组织中IL-6、p-STAT3、NF-κB p65和VEGF蛋白的表达水平。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组肿瘤组织中E-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白的表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组IL-6、p-STAT3、SOCS3基因的表达水平。结果 3组裸鼠胰腺肿瘤组织的平均瘤重及抑瘤率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示,模型对照组肿瘤组织细胞体积增大,癌细胞排列呈巢状;IL-6过表达组可见肿瘤组织轻度纤维化,少量炎症浸润;IgG抗体组可见核分裂象,大量肿瘤细胞坏死,局灶组织纤维化。IL-6过表达组E-cadherin蛋白、SOCS3基因表达水平低于模型对照组和IgG抗体组,而Vimentin、MMP-9、IL-6、p-STAT3、NF-κB p65、VEGF蛋白的表达水平及IL-6、NF-κB p65基因的表达水平高于模型对照组和IgG抗体组,差异均有统计学意义(P<0.05);IgG抗体组Vimentin、MMP-9、IL-6、p-STAT3、NF-κB p65、VEGF蛋白的表达水平及IL-6、NF-κB p65基因的表达水平低于模型对照组,而E-cadherin和SOCS3基因水平高于模型对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 IL-6可以通过p-STAT3和(或)NF-κB p65信号通路调节胰腺癌裸鼠模型肿瘤组织中的相关细胞因子,影响肿瘤组织的增殖及上皮间质化。

探讨HMGB1对诱导人肺腺癌上皮细胞(A549)上皮间质转化的影响

目的研究HMGB1对诱导人肺腺癌上皮细胞(A549)上皮间质转化的影响。方法通过不同浓度rHMGB1(0、0.5、1、2、4μg/mL)体外刺激A549细胞,western blot检测各浓度组vimentin蛋白相对表达量,得出rHMGB1体外刺激的最佳作用浓度。然后分三组实验,HMGB1组、TGF-β组(阳性对照)、control组(阴性对照),分别以2μg/mL rHMGB1、2μg/mL TGF-β、RPMI1640培养基体外刺激A549细胞。37℃、5%CO_(2)培养48 h或96 h后,MTT检测各组细胞增殖率、transwell检测各组细胞迁移能力,western blot检测各组细胞E-cadherin、vimentin和snail1蛋白相对表达量。结果HMGB1组和TGF-β组分别与control组比较,细胞增殖率显著增加(分别为P<0.0001和P<0.01);细胞迁移数量明显增加(P<0.0001);胞内snail1、vimentin蛋白相对表达量明显增加(P<0.0001),E-cadherin蛋白相对表达量明显降低(P<0.0001)。结论HMGB1体外有诱导人肺腺癌上皮细胞(A549)上皮间质转化的作用。

CircBICD2调节miR-218-5p/RhoA轴对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的:探讨环状RNA(CircRNA)·BICD2调节miR-218-5p/Ras同源基因家族成员A·(RhoA)轴对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法:qRT-PCR、Western·blot分别检测OSCC组织、癌旁组织、人口腔上皮细胞系HOEC及OSCC细胞系HSC-4、CAL-27、SCC-15中Circ·BICD2、miR-218-5p表达及Rho·A蛋白表达;将SCC-15细胞分为Ct组(A,未转染对照)、si-NC组(B)、si-Circ·BICD2组(C)、miR-NC组(D)、miR-218-5p组(E)、si-Circ·BICD2+anti-NC组(F)、si-Circ·BICD2+anti-miR-218-5p组(G),qRT-PCR检测细胞中Circ·BICD2、miR-218-5p表达;·CCK-8法和平板克隆实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;·Western·blot检测Rho·A、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达;双荧光素酶验证Circ·BICD2与miR-218-5p、miR-218-5p与Rho·A的关系。结果:在OSCC组织和细胞中,Circ·BICD2、Rho·A蛋白高表达,miR-218-5p低表达,在SCC-15细胞中miR-218-5p相对表达量最低,Circ·BICD2表达及Rho·A蛋白相对表达量最高(P<0.05)。后续实验取SCC-15细胞为研究对象;与B组比较,C组Circ·BICD2、Rho·A蛋白表达降低,miR-218-5p表达升高(P<0.05);与D组比较,E组miR-218-5p表达上调,Rho·A蛋白表达下调(P<0.05);与C组、F组相比,G组miR-218-5p表达降低,Rho·A蛋白表达升高(P<0.05)。下调Circ·BICD2或过表达miR-218-5p均可抑制SCC-15细胞增殖和EMT,促进细胞凋亡;下调miR-218-5p减弱了沉默Circ·BICD2对SCC-15细胞增殖、EMT的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用;·Circ·BICD2靶向调控miR-218-5p/Rho·A轴。结论:沉默Circ·BICD2可能通过上调miR-218-5p来抑制Rho·A表达,抑制SCC-15细胞增殖、EMT,促进细胞凋亡。

脂氧素A4对Ⅱ型肺泡上皮细胞-间质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell, ATⅡ)间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响及可能机制。方法 将A549细胞分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)组、空质粒+TGF-β1组、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组及LXA4+TGF-β1组。TGF-β1组以5 ng/mL TGF-β1干预A549细胞48 h;空质粒+TGF-β1组和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞先分别转染空质粒或Nrf2过表达质粒,再以5 ng/mL TGF-β1干预48 h;LXA4+TGF-β1组A549细胞先用100 nmol/L LXA4预处理6 h再给予5 ng/mL TGF-β1干预48 h。光镜观察细胞形态变化,免疫印迹及免疫荧光法检测上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达;免疫印迹法检测核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)蛋白水平。结果 与对照组相比,TGF-β1组光镜下可见部分A549细胞形态从鹅卵石状变成细长不规则状,呈间质性改变,E-cadherin表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增多(P<0.01),Nrf2蛋白水平下调(P<0.05)。与TGF-β1组相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞E-cadherin表达增多(P<0.05)、α-SMA表达减少(P<0.01);LXA4+TGF-β1组A549细胞E-cadherin上调、α-SMA下调以及Nrf2蛋白水平增多(P<0.05)。结论 LXA4可抑制A549细胞发生EMT,其机制与上调Nrf2表达相关。

非小细胞肺癌组织中miR-363-3p、SOX4 mRNA表达及对上皮间质转化进程的影响

目的探讨非小细胞肺癌组织中微小RNA-363-3p(miR-363-3p)、性别决定区Y框蛋白4(SOX4)表达及对上皮间质转化(EMT)进程的影响。方法收集行手术切除的84例非小细胞肺癌患者的癌及其癌旁组织。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测癌及癌旁组织miR-363-3p、SOX4 mRNA表达,免疫组化SP法检测癌及癌旁组织中E-cadherin、Vimentin表达。比较不同病理特征患者癌组织中miR-363-3p、SOX4 mRNA表达,采用Spearman秩相关分析癌组织miR-363-3p、SOX4 mRNA表达与E-cadherin、Vimentin相关性。使用相对超危险度比(RERI)、归因比(AP)、交互作用指数(SI)分析miR-363-3p、SOX4参与EMT进程的交互作用。结果癌组织中miR-363-3p表达低于癌旁组织,SOX4 mRNA表达高于癌旁组织(P均<0.05);癌组织中miR-363-3p、SOX4 mRNA表达与性别、年龄、吸烟史、肿瘤最大径无关(P均>0.05),与分化程度、TNM分期有关(P均<0.05);癌组织E-cadherin阳性表达率低于癌旁组织,Vimentin阳性表达率高于癌旁组织(P均<0.05);癌组织miR-363-3p与E-cadherin表达呈正相关(r=0.491,P<0.05),与Vimentin表达呈负相关(r=-0.506,P<0.05);癌组织SOX4 mRNA与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.527,P<0.05),与Vimentin表达呈正相关(r=0.463,P<0.05)。癌组织miR-363-3p、SOX4对EMT进程存在负向交互作用(RERI=29.639,AP=70.91,SI=3.656)。结论非小细胞肺癌组织中miR-363-3p、SOX4异常表达与EMT有关,且二者对EMT进程存在负向交互作用。

基于Traf6/TAK1通路探讨维生素D对甲状腺功能减退肾损伤幼鼠肾小管上皮细胞间充质转化的影响

目的探讨维生素D(VD)对甲状腺功能减退(HT)肾损伤幼鼠肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)的影响,以及其对肿瘤坏死因子受体相关因子6(Traf6)/转化生长因子-β活化激酶1(TAK1)通路的调控机制。方法通过丙基硫尿嘧啶(PTU)灌胃构建幼鼠HT模型,以过表达TAK1(pc DNA3.1-TAK1)作功能挽救实验;50只SPF级雄性SD大鼠分为正常组、HT组、VD低剂量(HT+VD-L)组、VD高剂量(HT+VD-H)组、HT+VD-H+pc DNA3.1-TAK1(HT+VD-H+pc)组,每组10只。全自动生化仪检测各组大鼠血清血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法试剂盒(TUNEL)检测肾组织中的细胞凋亡;免疫组化检测肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达;Western blot法检测肾组织中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Traf6、TAK1和磷酸化TAK1(p-TAK1)的表达。结果VD能明显降低HT幼鼠血清中Scr和BUN的含量,下调肾组织中的细胞凋亡率,降低肾组织中TGF-β1和α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达;抑制肾组织中Traf6、p-TAK1和Bax的表达,升高肾组织中Bcl-2的表达,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论维生素D能抑制HT幼鼠肾小管上皮细胞的EMT,降低肾组织中的细胞凋亡率,减轻肾组织的病理损伤,改善其肾功能,这与抑制Traf6/TAK1信号的激活有关。

基于上皮细胞-间充质转化的搜风愈喘方调控哮喘大鼠气道重塑的机制研究

目的探讨搜风愈喘方通过调控上皮细胞-间充质转化(EMT)抑制哮喘气道重塑的作用机制。方法将60只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组及搜风愈喘方高、中、低剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余各组均采用卵清白蛋白(OVA)注射和雾化复制哮喘大鼠模型。各组大鼠给予相应药物灌胃21 d后处死大鼠,苏木素-伊红(HE)染色,观察肺组织病理形态学变化;透射电镜观察大鼠肺组织中上皮细胞超微结构情况;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中的转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素17(IL-17)的含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测肺组织匀浆中TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的mRNA表达。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测肺组织中TGF-β1、α-SMA、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明显升高(P<0.01),肺组织中TGF-β1、α-SMA和N-cadherin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.01),E-cadherin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01);HE染色显示气道壁及肺泡壁增厚,视野内可见大量炎症细胞浸润,炎症评分明显升高(P<0.01);透射电镜显示肺组织中上皮细胞水肿程度严重,胞内基质局部溶解、变淡,细胞器肿胀明显。与模型对照组比较,地塞米松组和搜风愈喘方各剂量组大鼠血清中TGF-β1、IL-17含量明显降低(P<0.05,P<0.01),TGF-β1、α-SMA和N-cadherin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01);肺组织炎症细胞浸润减轻,支气管壁及肺泡壁增厚程度减轻,地塞米松组和搜风愈喘方高剂量组炎症评分降低(P<0.05);超微结构显示上皮细胞水肿程度明显减轻,细胞膜完整,胞内基质均匀,细胞器大多轻微肿胀。结论搜风愈喘方可降低TGF-β1水平,从而改善肺组织EMT,达到防治哮喘气道重塑的目的。

Gli2调控Hedgehog通路活化对Tca8113细胞增殖、转移和上皮间充质转化的影响

目的 本研究通过在细胞水平检测Gli2对口腔癌细胞Tca8113增殖、生长、迁移和侵袭的影响,明确Gli2调控口腔癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法 本研究利用siRNA抑制Tca8113细胞中Gli2的表达,通过CCK-8、平板克隆以及transwell小室实验分别检测Gli2对Tca8113细胞增殖、生长、迁移与侵袭的影响。进一步利用qRT-PCR与Western blot实验探究Gli2调控Tca8113细胞恶性增殖和转移机制。结果 口腔癌细胞Tca8113中Gli2的mRNA和蛋白表达升高。干扰Gli2表达可抑制Tca8113细胞增殖、生长、迁移及侵袭。进一步研究发现干扰Gli2表达可抑制Hedgehog(Hh)通路关键因子的mRNA与蛋白表达。此外,干扰Gli2表达可显著影响上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)通路关键因子的mRNA与蛋白表达。结论 口腔癌病变过程中Gli2被异常激活,干扰Gli2表达显著抑制口腔癌细胞的增殖、生长、迁移和侵袭。Gli2通过调控Hh通路与EMT通路,进而影响口腔癌细胞的迁移和侵袭。本研究为阐明口腔癌的发病机制提供新思路,并为口腔癌的临床治疗提供新视角。

lncSIL通过EZH2/P21/CDK6信号通路负向调控TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞间质转化

目的研究在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺泡上皮细胞间质转化(EMT)进程中lncSIL的作用及其相关信号通路。方法采用Western blot法研究沉默lncSIL后对TGF-β1诱导EMT进程中细胞标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)表达的影响;通过RNA pulldown分析lncSIL相互作用蛋白,并检测过表达或沉默lncSIL后对其靶基因组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(EZH2)以及下游因子P21蛋白(P21)和细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)表达的影响,并结合流式细胞术分析lncSIL对细胞周期进程的作用。结果沉默lncSIL后,间质细胞标志蛋白α-SMA和Col I表达升高,肺泡上皮细胞标志蛋白E-cad表达下降;RNA pulldown实验结果显示EZH2是与lncSIL相互作用的靶蛋白,并且沉默lncSIL后EZH2表达升高,其下游基因P21表达下调,CDK6表达上调,同时S期细胞的数量显著升高;过表达lncSIL时,EZH2与CDK6表达下调,P21表达上调,同时S期细胞的数量明显降低。结论lncSIL通过负向调控EZH2/P21/CDK6信号通路抑制细胞周期进程进而抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞向间质转化。

lncRNA HAGLR促卵巢癌细胞生长和上皮-间充质转化的机制研究

目的研究长链非编码RNA同源盒D基因簇反义生长相关长链非编码RNA(lncRNA HAGLR)通过调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin结构域蛋白3(NLRP3)炎症小体对卵巢癌细胞生长和上皮-间充质转化(EMT)的调控作用。方法培养卵巢正常细胞IOSE-80(IOSE-80组)以及卵巢癌细胞A2780(A2780组)。然后将A2780随机分为lncRNA HAGLR沉默组(siHAGLR组)、沉默阴性对照组(siNC组)、siHAGLR联合NLRP3抑制剂MCC950处理组(siHAGLR+MCC950组)。qRT-PCR法检测lncRNA HAGLR的表达。Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、caspase-1、ASC和EMT相关蛋白Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1的表达。CCK-8法检测A2780细胞的增殖活性。Transwell法检测A2780细胞的迁移和侵袭能力。细胞克隆形成实验检测A2780细胞的生长能力。TUNEL染色检测A2780细胞的凋亡。结果与IOSE-80组相比,A2780组lncRNA HAGLR、Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1表达均上调(P<0.05),但NLRP3、caspase-1、ASC的表达均下调(P<0.05)。与siNC组相比,siHAGLR组的lncRNA HAGLR、Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1表达均下调(P<0.05),但NLRP3、caspase-1、ASC的表达均上调(P<0.05),细胞增殖率、细胞克隆数以及迁移和侵袭数均明显减少(P<0.05),细胞凋亡数则增加(P<0.05)。与siHAGLR组相比,siHAGLR+MCC950组的lncRNA HAGLR表达无明显变化(P>0.05),而Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1表达均上调(P<0.05),但NLRP3、caspase-1、ASC的表达均下调(P<0.05),细胞增殖率、细胞克隆数以及迁移和侵袭数均显著增加(P<0.05),细胞凋亡数则减少(P<0.05)。结论lncRNA HAGLR通过抑制NLRP3炎症小体促进卵巢癌细胞的生长和EMT。

miR-498过表达对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化的影响及其机制

目的探讨微小RNA-498(miR-498)过表达对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法体外传代培养人永生化鼻咽上皮细胞系NP69及人鼻咽癌细胞系CNE-2Z、CNE-1、HNE-1、SUNE-1,采用RT-qPCR法检测各细胞miR-498表达,选择miR-498表达最低的鼻咽癌细胞进行后续实验。取传3代、对数生长期、生长状态良好的鼻咽癌细胞,随机分为miR-498 mimics组和NC mimics组,分别转染miR-498 mimics、NC mimics。转染6 h更换新鲜培养基继续培养24 h,收集细胞。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,采用平板克隆形成实验检测集落形成能力,采用Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力,采用Western blotting法检测EMT相关上皮型钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(Fibronectin)以及高迁移率族蛋白A2(HMGA2)表达。结果CNE-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1细胞miR-498相对表达量均低于NP69细胞(P均<0.05)。以CNE-2Z细胞miR-498相对表达量最低,故选择该细胞系进行后续实验。经验证,miR-498 mimics组miR-498相对表达量高于NC mimics组(P<0.05)。miR-498 mimics组培养0、24、48、72 h细胞增殖活性均低于NC mimics组(P均<0.05);miR-498 mimics组集落形成能力以及细胞侵袭和迁移能力均低于NC mimics组(P均<0.05);miR-498 mimics组Vimentin、Fibronectin、HMGA2蛋白相对表达量均低于NC mimics组,E-cadherin蛋白相对表达量高于NC mimics组(P均<0.05)。结论鼻咽癌细胞miR-498低表达;miR-498过表达则能抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及EMT,其机制可能与靶向调控HMGA2表达有关。

白屈菜红碱对人卵巢癌SKOV3细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的影响

目的:探讨白屈菜红碱(CHE)对人卵巢癌SKOV3细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的抑制作用,阐明其相关作用机制。方法:体外培养SKOV3细胞,分为对照组和2.5、5.0、10.0、20.0及40.0μmol·L^(-1)CHE组,采用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率。体外培养SKOV3细胞,分为对照组、转移生长因子β1(TGF-β1)组、TGF-β1+5μmol·L^(-1)CHE组和TGF-β1+10μmol·L^(-1)CHE组,采用细胞划痕实验检测各组细胞迁移率,Transwell小室实验检测各组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数,Westren blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达水平,免疫荧光染色法检测各组细胞中E-cadherin和N-cadherin荧光强度。结果:MTT法,与对照组比较,5.0、10.0、20.0和40.0μmol·L^(-1)CHE组细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05或P<0.01)。细胞划痕实验,与对照组比较,TGF-β1组细胞迁移率明显升高(P<0.01);与TGF-β1组比较,TGF-β1+5μmol·L^(-1)CHE组和TGF-β1+10μmol·L^(-1)CHE组细胞迁移率明显降低(P<0.01)。Transwell小室实验,与对照组比较,TGF-β1组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数明显增加(P<0.05);与TGF-β1组比较,TGF-β1+5μmol·L^(-1)CHE组和TGF-β1+10μmol·L^(-1)CHE组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少(P<0.01)。Westren blotting法,与对照组比较,TGF-β1组细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与TGF-β1组比较,TGF-β1+5μmol·L^(-1)CHE组和TGF-β1+10μmol·L^(-1)CHE组细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。免疫荧光染色,与对照组比较,TGF-β1组细胞中E-cadherin荧光强度明显降低,N-cadherin荧光强度明显升高;与TGF-β1组比较,TGF-β1+5μmol·L^(-1)CHE组和TGF-β1+10μmol·L^(-1)CHE组细胞中E-cadherin荧光强度明显升高,N-cadherin荧光强度明显降低。结论:CHE能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂CUDC-101对前列腺癌DU145细胞DNA损伤、迁移和上皮-间质转化的影响

目的:探讨泛素化组蛋白(H2AX)在前列腺癌(PCa)和癌旁良性前列腺组织中的表达及与其PCa患者临床病理参数之间的关系,阐明新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)CUDC-101对PCa的DNA损伤、迁移及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:肿瘤基因组谱(TCGA)数据库和UALCAN数据库检索各种癌症组织中H2AX mRNA的表达情况及其在PCa与正常前列腺组织中的表达差异,分析其表达与PCa患者临床预后的关系;采用免疫组织化学染色法检测在PCa组织和癌旁良性前列腺组织中H2AX蛋白的表达情况,分析H2AX蛋白表达与PCa患者临床病理参数的关系;体外培养DU145细胞,分为对照组、5%FBS组、5%FBS+100μmol·L^(-1)CUDC-101组和5%FBS+200μmol·L^(-1)CUDC-101组,采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测CUDC-101处理前后PCa DU145细胞的细胞划痕面积及迁移细胞数;免疫荧光染色法检测CUDC-101处理后PCa DU145细胞中上皮细胞标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)和磷酸化组蛋白γ-H2AX表达情况;Western blotting法检测CUDC-101处理后EMT相关蛋白、γ-H2AX和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表达情况。结果:TCGA数据库和UALCAN数据库分析,H2AX mRNA在PCa组织中高表达,并且H2AX低表达组患者的无病生存期(DFS)明显高于H2AX mRNA高表达组(P<0.001);免疫组织化学染色,在PCa组织中H2AX蛋白强阳性表达率高于在癌旁良性前列腺组织(64.34%vs 14.29%),其过表达与PCa的T分期(P=0.001)和世界卫生组织/国际泌尿科病理学会(WHO/ISUP)预后分级分组(P=0.004)有关,但与PCa患者的年龄、Gleason评分、淋巴结转移、神经和脉管浸润无关(P>0.05);免疫荧光染色法检测,与对照组和EMT诱导组比较,CUDC-101处理组E-cadherin和γ-H2AX蛋白的荧光表达增强;细胞划痕实验和Transwell小室实验检测,与对照组比较,CUDC-101处理组DU145细胞愈合面积和迁移细胞数明显下调;Western blotting法检测,与EMT诱导组比较,CUDC-101处理组E-cadherin和γ-H2AX蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),波形蛋白(Vimentin)和p-AKT蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:H2AX蛋白过表达与PCa患者的不良预后密切关联。新型HDACi抑制剂CUDC-101可调控H2AX和AKT的磷酸化,抑制PCa细胞EMT过程。

石见穿多糖对结肠癌SW620细胞上皮间质转化的影响

目的研究石见穿多糖对结肠癌SW620细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,探讨石见穿多糖抑制结肠癌侵袭转移的作用机制。方法采用不同浓度石见穿多糖对SW620细胞进行干预,干预时间分别为12小时和24小时;CCK-8法检测各组细胞的增殖,并选择后续实验的药物浓度和时间;细胞划痕和Transwell迁移实验来检测各组细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭力;Western blot和qRT-PCR方法检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin及其mRNA,以及转录因子ZEB1、ZEB2、Twist1及其mRNA的表达。结果与对照组比较,石见穿多糖能够抑制SW620细胞的增殖,且浓度越高、干预时间越长,抑制作用越强,且呈浓度和时间依赖性。因此,在后续实验中,选择0.25 mg·mL^(-1)、1 mg·mL^(-1)、2 mg·mL^(-1)、3 mg·mL^(-1)作为干预浓度,选择24 h作为干预时间。与对照组比较,石见穿多糖能够抑制SW620细胞的迁移和侵袭,且浓度越高,抑制作用越强,呈浓度依赖性;与对照组比较,石见穿多糖能够上调E-cadherin及其mRNA的表达,且浓度越高,表达水平越高,呈浓度依赖性;同时下调Vimentin、ZEB1、ZEB2、Twist1及其mRNA的表达,且浓度越高,表达水平越低,呈浓度依赖性。结论石见穿多糖能够抑制SW620细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与上调E-cadherin的表达,下调Vimentin、ZEB1、ZEB2和Twist1的表达,从而抑制EMT过程有关。

安罗替尼对脑胶质瘤T98G细胞迁移侵袭及上皮间质转化的抑制作用

目的探究安罗替尼对人脑胶质瘤细胞黏附、迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响。方法体外培养人脑胶质瘤T98G细胞,分为对照组(不做干预)、实验组(2.5μmol·L^(-1)安罗替尼组、5μmol·L^(-1)安罗替尼组、10μmol·L^(-1)安罗替尼组)和阳性药物组(50 mg·L^(-1)5-氟尿嘧啶),干预24 h。用活细胞计数(CCK-8)、细胞黏附实验、划痕法、Transwell小室及蛋白免疫印迹(WB)法对细胞增殖活力、黏附、迁移、侵袭能力及EMT相关蛋白表达量进行分析。结果与对照组比较,5μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)安罗替尼组和阳性药物组增殖活力显著降低(P<0.05),实验组和阳性药物组T98G细胞黏附、迁移、侵袭能力,纤维粘连蛋白(FN)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白的表达水平呈现显著下调趋势(P<0.05),而E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白的表达水平呈现明显上调趋势(P<0.05),且浓度越高变化越显著;与阳性药物组相比,2.5μmol·L^(-1)、5μmol·L^(-1)安罗替尼组细胞增殖活力、黏附、迁移、侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN的蛋白水平上调(P<0.05),而E-cadherin蛋白水平则下调(P<0.05);10μmol·L^(-1)安罗替尼组与阳性药物组相比无显著差异(P>0.05)。结论安罗替尼可能是通过抑制EMT进程进而抑制人脑胶质瘤T98G细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭能力。

黄芩素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭、迁移、上皮间充质转化的调控作用及其机制

目的观察黄岑素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的侵袭、迁移及上皮间充质转化(EMT)的调控作用,探讨其可能作用机制。方法取对数生长期MDA-MB-231细胞分为一组、二组、三组及对照组,一组、二组、三组分别加入2.5、5、10μmol/L的黄岑素,对照组不做任何处理。培养48 h时采用划痕修复实验观察四组细胞迁移能力、采用Transwell侵袭实验观察四组细胞侵袭能力,采用Western Blotting法检测细胞EMT标志物波形蛋白(vimentin)及E-钙黏蛋白(E-cadherin)、整合素αv、β3、磷酸化黏着斑激酶(p-FAK)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(整合素p-PI3K)。结果与对照组相比,黄岑素组细胞迁移率降低、侵袭细胞数少,细胞E-cadherin相对表达量高,vimentin、整合素αv、整合素β3、p-FAK、p-PI3K蛋白相对表达量低,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。结论黄芩素抑制MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移及EMT。黄岑素可能通过抑制整合素αv、整合素β3表达,进一步抑制p-FAK、p-PI3K蛋白表达,抑制MDA-MB-231的侵袭、迁移及EMT。