克服昆明小鼠早胚2-细胞阻滞的研究

目的 :评价两种培养液对昆明小鼠胚胎 2 -细胞阻滞的克服效果 .方法 :用添加 15%FCS或BSA的M16和CZB培养液培养昆明小鼠 2 -细胞胚胎和体外受精卵 ,以观察这两种培养液对昆明小鼠早胚发育的影响及在克服昆明小鼠 2 -细胞阻滞中的作用 ,并通过CZB培养液中葡萄糖成份的增减 ,了解其作用及效应时间 .结果 :添加FCS的M16和CZB培养液均能较好地支持 2 -细胞胚胎发育到囊胚 ( 78 9% ,72 7% ) .当进行体外受精卵培养时 ,胚胎在M16培养液中仅有7 4 %突破 2 -细胞阻滞 ;但在CZB培养液中 ,有 72 3%能发育通过 2 -细胞期 ,并有 17%到达囊胚 .进一步 ,于培养的第 3d在CZB培养液中加入葡萄糖 ,其桑椹胚以上及囊胚发育率明显提高( 66 7%、2 8 1% ) .结论 :昆明小鼠体外受精卵在含 15%FCS的CZB培养液中可较好地克服 2 -细胞阻滞 ,并形成囊胚 .在培养的第

M16添加硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ无法克服昆明小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞

目的观察硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Peroxiredoxin Ⅱ,PrxII)是否可以克服昆明(Kunming)小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞。方法取昆明小鼠1-细胞胚置于含PrxII蛋白的M16培养液中培养,观察PrxII对昆明小鼠早胚发育潜能和2-细胞胚内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;同时比较昆明和B6C3F1小鼠1-细胞胚在M16中各自的发育情况;激光扫描共聚焦显微镜分别检测比较昆明与B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平以及昆明小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内ROS水平。结果M16培养液中添加PrxII蛋白(1nmol/L和100nMol/L)可以明显降低昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平(P<0.05),但不能克服昆明小鼠体外发育2-细胞阻滞;昆明小鼠1-细胞胚在M16中培养存在2-细胞阻滞现象,而B6C3F1小鼠无2-细胞阻滞现象;昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平显著低于体内发育2-细胞胚(P<0.05),亦略低于B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平(P>0.05)。结论M16培养液中添加PrxII可以明显降低2-细胞胚内ROS水平,但并不能克服2-细胞阻滞。与昆明小鼠体内发育2-细胞和B6C3F1体外发育2-细胞胚相比,体外培养昆明小鼠2-细胞胚内ROS水平并不升高,这些结果提示昆明小鼠体外培养出现2-细胞阻滞的原因并非是胚内ROS水平升高引起。

“生存还是毁灭”,发育还是阻滞──小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞产生机制初析

在体外培养条件下，小鼠受精卵往往经一次分裂后就停滞在２－细胞期，不能完成到达囊胚的后续发育过程；称作２－细胞阻滞。氧自由基伤害、培养液成分不平衡等外界因素都能引起阻滞。小鼠的２－细胞阻滞现象受细胞质内母型物质制约，具有品系依赖性。在阻滞品系小鼠胚胎的细胞质内可能缺乏某些重要的蛋白因子，在无外源信号的培养体系内不能继续分裂。发生阻滞的胚胎细胞内ＭＰＦ前体物虽然储备充足，但因无法去磷酸化激活而最终导致发育阻滞。阻滞发生的时间同合子型基因激活（ＺＧＡ）开启的时间刚好相吻合，而在２－细胞阻滞的胚胎中，ＺＧＡ未开启。总之，体外培养环境的不利影响、外源信号的丧失及胚胎细胞质内母型蛋白质的匮乏都阻碍了合子钟对 ＺＧＡ的正常调控。而 ＭＰＦ的正常激活则是 ＺＧＡ后的下游事件。所以 ＺＧＡ不能开启很可能是导致 ２－细胞阻滞的关键原因。

从细胞阻滞模型来看流式细胞术中细胞周期分析的误区

目的:探讨流式细胞术中细胞周期常规分析方法的误区和潜在的合理分析方法。方法:设立空白对照,观察MOLT-4细胞经0.1μmol·L-1喜树碱诱导细胞周期阻滞7h后细胞周期变化情况,并从常规DNA直方图分析法(方法一)和本实验意外发现的方法(方法二)进行细胞周期分析,并评价两种方法获得的结果。结果:方法一分析的细胞周期分布结果G0/G1期、S期和G2/M期分别为(65.42±4.73)%、(25.01±2.58)%、(9.57±1.96)%,方法二分析结果分别为(31.51±2.13)%、(59.32±5.92)%、(9.17±1.61)%。两种分析方法获得的结果存在显著差异(n=8,P<0.01)。结论:流式细胞术常规细胞周期分析方法存在严重的误区。一种新的基于细胞周期特异性标志物的定量技术或形态学方法应用于细胞周期的分析较合理。

p-CREB在小鼠植入前胚的表达及其与2-细胞阻滞的关系

目的观察p-CREB在小鼠植入前胚以及阻滞品系(昆明小鼠)与非阻滞品系(B6C3F1小鼠)2-细胞胚的分布与表达,初步探讨p-CREB在小鼠植入前胚中的作用以及与小鼠2-细胞阻滞的关系。方法利用激光扫描共聚焦显微镜检测p-CREB在B6C3F1小鼠植入前胚中的定位,比较不同品系小鼠体外培养以及B6C3F1小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内p-CREB的表达变化。结果p-CREB的免疫阳性反应在小鼠1-细胞胚中主要分布于细胞质中;2-细胞胚及其后期植入前胚主要定位于细胞核内;昆明小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著低于同一条件发育的B6C3F1小鼠,B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著高于体内发育。结论p-CREB在小鼠植入前胚发育中起重要作用,p-CREB在昆明小鼠2-细胞胚核内表达较低可能与小鼠2-细胞阻滞有关。

长春花碱诱导MOLT-4细胞产生M期细胞阻滞的初步研究

本研究探讨化疗药物M期阻滞剂长春花碱(vinblastine,VLS)对MOLT-4急性淋巴细胞白血病细胞株产生的生物学影响并分析其意义。0.05μg/ml的VLS诱导MOLT-4细胞0-12小时产生M期细胞阻滞和/或细胞凋亡,流式细胞术检测DNA直方图和共聚焦显微镜观测细胞形态,采用阻滞增长率、阻滞效率、凋亡率及形态学指标分析阻滞前后的细胞周期分布、凋亡和细胞形态变化。结果表明,细胞阻滞可不伴随有凋亡率的显著增加;细胞阻滞的流式DNA直方图呈时间依赖的细胞周期分布动态改变,阻滞程度可量化;M期阻滞伴随有S期细胞堆栈;阻滞后细胞增殖率减低;M期阻滞细胞具有特征性细胞分裂的形态学特征。结论:长春花碱能单独诱导MOLT-4细胞M期阻滞,M期细胞阻滞的流式细胞检测和形态学特征的研究有助于进一步研究细胞阻滞与凋亡、检测点机制和抗癌新药开发提供参考。

CA-4类衍生物LGD5诱导人宫颈癌HeLa细胞发生G2/M周期阻滞和凋亡的机制研究

目的:探究微管抑制剂CA-4类衍生物LGD5对人宫颈癌HeLa细胞的作用机制。方法:选用HeLa细胞,分为空白组、CA-4阳性对照组、不同浓度的LGD5组成实验组。采用MTT法考察LGD5对HeLa细胞的生长抑制情况并确定实验浓度,采用倒置显微镜和吖啶橙染色观察用药前后HeLa细胞形态学变化及细胞凋亡情况,采用DAPI免疫荧光染色考察LGD5对微管的作用,采用PI流式细胞术考察LGD5对细胞周期的影响,采用蛋白免疫印迹法考察LGD5对细胞周期蛋白和凋亡相关蛋白的影响。结果:MTT实验结果显示LGD5抑制HeLa细胞的生长抑制具有时间依赖性和剂量依赖性。定时拍照和吖啶橙染色观察到LGD5诱导HeLa细胞发生凋亡,并产生明显的染色质凝集和凋亡小体。DAPI染色观察到LGD5抑制HeLa细胞的微管聚合。PI流式细胞术结果显示LGD5诱导HeLa细胞发生G2/M周期阻滞,在12 h内具有时间依赖性和剂量依赖性,且差异有统计学意义(P<0.01),24 h以后引起细胞凋亡且具有时间依赖性;Western blot结果显示,LGD5下调Cdc2和Cdc25C,上调p-Cdc2、Cyclin B1和p-histone H3,进一步验证LGD5诱导HeLa细胞发生G2/M周期阻滞,除此之外,LGD5使HeLa细胞Caspase 3表达增加,上调Caspase 9和Bax,下调Pro-caspase 9和Bcl-2,说明LGD5诱导HeLa细胞凋亡与线粒体途径有关。结论:CA-4类衍生物LGD5可抑制HeLa细胞的微管聚合,诱导其发生G2/M周期阻滞,进而通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。

靛玉红通过下调Cyclin A2阻滞细胞周期抑制小鼠Lewis肺癌的体内外及网络药理学研究

目的研究中药成分靛玉红在体内外对小鼠Lewis肺癌(LLC)的抑制效果及对细胞周期的调节作用。方法通过细胞毒性实验探究靛玉红在体外对小鼠LLC细胞的抑制作用。构建肺癌原位小鼠模型,随机分为模型组(磷酸盐缓冲液灌胃,每天1次)和靛玉红低、中、高剂量组(25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg灌胃,每天1次)、顺铂组(2 mg/kg腹腔注射,每3天1次),连续3周,记录生存期和体质量。通过活体成像法记录小鼠肺癌进展,取肺肿瘤组织,称重并计算抑瘤率。通过网络药理学预测靛玉红治疗肺癌的核心靶点和通路。Western blot法分别验证靛玉红在体外对LLC细胞及在体内对小鼠肺癌组织中细胞周期蛋白A2(Cyclin A2)表达的影响;免疫组织化学染色(IHC)法和实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测靛玉红对小鼠肺癌组织中Cyclin A2蛋白及其编码基因CCNA2表达的影响。流式细胞术和IHC法分别检测靛玉红对小鼠肺癌肿瘤细胞的细胞周期和肺癌肿瘤增殖抗原Ki-67表达的影响。结果靛玉红在体外对小鼠LLC细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性,24 h、48 h、72 h的半抑制浓度(IC_(50))分别为188.7μmol/L、109.0μmol/L、58.3μmol/L。与模型组比较,靛玉红中剂量组小鼠肺部荧光表达降低(P<0.05),生存率提高(中位生存期延长7 d),肿瘤抑制率较高(37.76%),且对小鼠体质量没有明显影响(P>0.05)。网络药理学分析表明,靛玉红抑制肺癌可能通过调控细胞周期及Cyclin A2实现。进一步研究证明,靛玉红通过抑制Cyclin A2,导致细胞周期S期阻滞,抑制肿瘤细胞增殖。结论靛玉红体外抑制小鼠LLC细胞,体内通过下调肺癌肿瘤细胞Cyclin A2导致细胞周期阻滞,抑制肿瘤进展,延长肺癌小鼠生存期。

诱导内皮细胞周期阻滞可阻止遗传性出血性毛细血管扩张症中的动静脉畸形

遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)是以毛细血管扩张与动静脉畸形(arteriovenous malformation,AVM)为特征的血管疾病。已有研究表明内皮细胞异常增殖与AVM有关,但内皮细胞周期调控是否参与AVM的发生尚不清楚。

几种克服昆明小鼠 2- 细胞胚胎发育阻滞的培养液研究

比较了几种培养液对克服昆明小鼠胚胎 2 细胞发育阻滞的效果。实验 1的结果表明 ,在M16及CZB培养液基础上 ,加减几种成分得到的改进M16培养液 (用mM 16表示 )和改进的CZB培养液 (用mCZB表示 )均能有效克服 2 细胞阻滞现象。除去M 16和CZB培养液中的葡萄糖和磷酸盐后添加 5 5 5mmol/L (1g/L)果糖、2 5mmol/L牛磺酸、 10 0或110 μmol/LEDTA、 2mmol/L谷氨酰胺和 2 %必需氨基酸 (EAA)及 1%非必需氨基酸(NEA) ,均可支持体外培养的昆明小鼠 1 细胞胚胎发育到囊胚和孵化囊胚阶段。实验结果同时证明 ,TE培养液也具有良好的培养效果。 1 细胞胚胎在mM 16、TE和mCZB中培养后发育到囊胚的比率分别为 85 %、 85 %和 6 8%。实验 2的结果表明 ,在M 16培养液中单独添加 2 5mmol/L的牛磺酸也可支持体外培养的昆明小鼠 1 细胞胚胎发育到囊胚。在M16中同时添加 2 5mmol/L牛磺酸和 10 0 μmol/LEDTA两种成分可使 1 细胞胚胎的囊胚发育率达到 6 7%。通过比较分析我们认为牛磺酸对克服昆明小鼠胚胎 2 细胞阻滞起关键作用 。

TRIP13基因新突变导致卵母细胞成熟阻滞为特征的女性不孕

卵母细胞成熟阻滞(oocyte maturation arrest,OMA)是指卵母细胞减数分裂过程异常而导致的卵母细胞成熟障碍的一种罕见的临床现象,也是女性原发性不孕的原因之一。这类患者临床上常表现为:反复促排卵后无法获得成熟卵子,并且未成熟卵母细胞经体外培养后仍不能成熟。迄今研究发现PATL2、TUBB8和TRIP13基因突变与OMA有关,但是有关OMA的遗传学分子因素及机制研究仍不完整。本研究通过收集临床上辅助生殖助孕过程中35名反复出现OMA的原发不孕女性患者的外周血,提取其基因组DNA进行全外显子组测序分析,对疑似致病突变进行验证及家系共分离分析,发现先证者1的TRIP13基因9号外显子存在纯合突变c.859A>G,突变导致对应编码的287位的氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸(p.Ile287Val);先证者2的TRIP13基因1号外显子存在纯合突变c.77A>G,突变导致对应编码的26位的氨基酸由组氨酸突变为精氨酸(p.His26Arg);先证者3的TRIP13基因的4号和12号外显子存在复合杂合突变c.409G>A和c.1150A>G,c.409G>A突变导致对应编码的137位的氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺(p.Asp137Asn),c.1150A>G突变导致对应编码的384位的氨基酸由丝氨酸突变为甘氨酸(p.Ser384Gly),三名患者所携带的突变均引起TRIP13基因编码的TRIP13蛋白发生错义突变。其中3个突变位点在国内外尚未有文献报道。此外,通过在HeLa细胞中分别转染四个突变质粒,并进行体外免疫印记实验和细胞增殖实验,发现这些突变会造成不同程度的TRIP13蛋白表达的增加以及细胞增殖速率异常。本文总结了既往研究报道的TRIP13基因突变位点,丰富了TRIP13致病基因突变谱,为进一步研究TRIP13基因导致OMA的致病机制及临床的诊断和治疗提供了依据。

苯并(a)芘对不同时相人胚肺成纤维细胞阻滞作用

目的研究低遗传损伤浓度苯并（a）芘（BaP）对人胚肺成纤维细胞（HELF）的细胞周期调控的影响。方法0.5%血清饥饿法及10%血清再刺激方法获得处于各细胞周期时相的HELF;分别以二甲基亚砜（DMSO）、2,10和50μmol/L BaP于血清再刺激后10-12,16-18和22-24 h作用HELF2 h;采用流式细胞术分析细胞周期分布;采用蛋白印迹法分析细胞周期调控蛋白Cyclin D、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B、P53、P21和P16表达。结果BaP针对血清再刺激后10-12,16-18和22-24 h作用均引起明显的S期细胞比例的下降;血清再刺激后10-12 h作用引起G0/G1期细胞比例增加,BaP低、中、高浓度组分别为36.79%,42.73%,43.28%,伴随Cyclin D表达明显下降;血清再刺激后16-18 h作用引起G2/M期细胞比例增加,BaP低、中、高浓度组分别为18.46%,23.55%,28.44%,伴随P53和P21表达增强;血清再刺激后22-24 h作用引起G0/G1期细胞比例增加,BaP低、中、高浓度组分别为38.92%,54.08%,51.69%，伴随P53和P21表达增强。结论BaP针对不同时相的HELF作用顺序激活了G1和G22种周期关卡监控机制，并产生相应的周期阻滞效应。

小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的研究

为探讨小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的机制,本试验以昆明小鼠为研究对象,通过输卵管上皮细胞和垂体细胞作为饲养层培养小鼠孤雌胚胎,分析其作用机理。小鼠卵母细胞通过70mL/L乙醇激活5min,再用2mmol/L 6-DMAP、5μg/mL CB激活3h后,分别在不同饲养层的KSOM培养液中进行培养,观察并比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。结果,培养至第24小时,各组无显著差异(P>0.05),都有较高卵裂率。培养至第48小时,用两种饲养层细胞培养的孤雌胚胎4-细胞～8-细胞发育效果好,与用单独一种饲养层细胞培养相比,差异显著(P<0.05),与对照组相比,差异极显著(P<0.01);发育至桑囊胚的比例为49.4%(42/85)(P<0.01)。结果表明,含有输卵管上皮细胞和垂体细胞的KSOM培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎的发育并通过2-细胞阻滞(通过2-细胞阻滞率为74.1%),并可进一步提高其发育率(桑囊胚率为49.4%)。

阻滞和非阻滞品系小鼠体外发育2-细胞胚基因表达水平的比较

检测阻滞品系昆明小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠体外发育2-细胞胚内基因表达水平的差异，探讨昆明小鼠植入前胚体外发育阻滞与哪些基因表达调控有关。方法：分别收集昆明小鼠和B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚，运用基因芯片分析和Real-timePCR验证。结果：基因芯片检测共筛出差异表达基因303个，其中昆明小鼠2-细胞胚表达上调基因有168个；下调基因有135个。昆明小鼠2-细胞胚表达上调的基因以信号转导、细胞周期、细胞结构和运动、细胞增殖和分化以及发育进程等为主；而下调基因与电子转移、蛋白质代谢和修饰、氨基酸代谢以及蛋白质靶向运输和定位等相关。结论：胚内能量供应不足和蛋白质合成障碍可能是昆明小鼠植入前胚体外发育出现2-细胞阻滞的重要原因。

土贝母皂苷诱导人宫颈癌HeLa细胞周期阻滞和细胞凋亡

【摘要】背景和目的:土贝母皂苷是由传统中药土贝母块茎中分离得到的,由土贝母苷甲(79%)和土贝母苷乙(21%)组成。本研究旨在探讨土贝母皂苷抗肿瘤作用的机制。方法:MTT法检测土贝母皂苷对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期,荧光显微镜和电子显微镜观察细胞形态,琼脂糖凝胶电泳检测DNA电泳图谱的变化。结果:土贝母皂苷对人宫颈癌HeLa细胞的生长具有强抑制作用,且这种作用呈时间剂量依赖关系,处理24、48和72h的IC50值分别为20.0、18.8和8.8μmol/L。流式细胞术分析显示,15、30、35μmol/L土贝母皂苷处理5h,HeLa细胞G2/M期细胞数从9.80%分别增加到21.90%、25.92%和27.00%;处理12h,G2/M期细胞数增加更显著,从8.20%分别增加到21.40%、31.15%和34.55%。40μmol/L土贝母皂苷处理一定时间,形态学检查发现细胞核明显皱缩、核染色质凝集边聚等特征,流式细胞术检测发现凋亡峰,DNA琼脂糖凝胶电泳可见明显的梯形条带。结论:土贝母皂苷使细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡可能在其抗肿瘤作用中具有重要意义。

小檗碱增强丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞周期阻滞及凋亡

目的:研究小檗碱(berberine,Ber)增强丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)诱导的人类膀胱癌T24细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用及其相关机制。方法:将T24细胞分为4组:对照组、MMC组、MMC+Ber组和Ber组;采用CCK-8法检测不同药物处理后T24细胞的活力;采用流式细胞术分析不同药物处理后T24细胞周期的情况;Western blot检测细胞周期调控相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达;Annexin V-FITC/PI双染后用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:CCK-8实验表明Ber能增强MMC抑制T24细胞活力的作用;流式细胞术检测细胞周期结果显示,MMC+Ber组T24细胞滞于G_0/G_1期(P<0.05);与MMC组相比,MMC+Ber组p21和p27的蛋白表达上调(P<0.05),cyclin D1、CDK2和CDK4的蛋白表达下调(P<0.05),同时Ber促进MMC下调survivin的蛋白表达(P<0.05);Annexin V-FITC/PI双染结果显示,Ber能促进MMC诱导的T24细胞凋亡(P<0.05)。结论:Ber能显著增强MMC抑制T24细胞活力的作用,其机制可能是通过上调p21和p27,进而抑制cyclin D1、CDK2和CDK4表达;同时通过抑制survivin蛋白的表达,最终导致细胞被阻滞在G_0/G_1期,并促进细胞凋亡。

去甲斑蝥素诱导活性氧的产生介导SKOV3细胞凋亡和G2/M期周期阻滞

目的:研究去甲斑蝥素对人卵巢癌SKOV3细胞的细胞毒作用及作用机制。方法:MTT法检测去甲斑蝥素对细胞增殖的影响,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞的形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,蛋白印迹法检测相关蛋白的表达。结果:去甲斑蝥素能够时间和剂量依赖性地抑制SKOV3细胞生长。52μmol/L的去甲斑蝥素作用12~48 h后可使细胞核皱缩、染色质凝聚,形成明显的凋亡小体;还可时间依赖性地诱导细胞凋亡、G2/M期周期阻滞以及活性氧的产生。活性氧清除剂NAC可以显著降低去甲斑蝥素诱导的活性氧的产生,抑制细胞凋亡和G2/M期周期阻滞(P<0.05)。5 mmol/L NAC抑制去甲斑蝥素引起的Bax和p21表达上调,增加去甲斑蝥素引起的procaspase-3和Bcl-2的表达降低。结论:去甲斑蝥素通过升高活性氧的水平介导SKOV3细胞凋亡和G2/M期周期阻滞。

蜂毒素对SGC-7901细胞生长及G_2/M期阻滞的影响

目的研究蜂毒素(Melittin)对胃上皮癌细胞SGC-7901细胞生长及细胞周期阻滞的影响。方法采用罗丹明B(SRB)染色法观察Melittin对SGC-7901细胞株生长曲线的影响;用流式细胞仪检测Melittin对该细胞周期阻滞的影响;RT-PCR检测细胞周期相关基因mRNA的表达。结果Melittin(1、2、4、8×10-3μg·L-1)体外给药24h,能抑制SGC-7901细胞的增殖活性(P<0.05orP<0.01);Melittin(4、8×10-3μg·L-1)作用SGC-790124h后,能明显阻滞该细胞株于G2/M期;并且降低G2/M期相关基因CylinB1-CDK1-Cdc25c mRNA的表达。结论Melittin具有抑制胃上皮癌细胞SGC-7901增殖的作用,其机制可能与干扰该细胞G2/M期相关基因的转录有关。

香叶木素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及周期阻滞的机制研究

目的研究香叶木素对人肝癌HepG2细胞的增殖、凋亡及周期阻滞的影响并揭示其分子机制。方法 MTT方法检测不同浓度香叶木素对肝癌HepG2的细胞活力的影响;流式细胞术检测不同浓度香叶木素处理对HepG2细胞周期阻滞及细胞凋亡的作用;Western blot检测香叶木素处理对细胞p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak、cdc2、cyclin B1、p21等细胞周期调节或细胞凋亡相关蛋白表达的调节。结果香叶木素能显著抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并且诱导细胞凋亡(P<0.05);流式细胞术对细胞周期检测示:香叶木素处理HepG2细胞,使G0/G1期细胞比例显著降低,而G2/M期细胞比例显著升高(P<0.05)。香叶木素可下调HepG2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、cdc2、cyclin B1的蛋白表达,上调p53、p21、Bax、Bak,Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP等促凋亡蛋白。结论香叶木素在体外实验能通过激活p53/Bcl-2细胞凋亡通路抑制人肝癌HepG2细胞的增殖及促进细胞凋亡,同时通过上调p53、p21下调cdc2、cyclin B1诱导细胞G2/M周期阻滞。

淋巴细胞微粒刺激AKT/Foxo1阻滞气道上皮细胞周期的研究

目的研究淋巴细胞微粒(lymphocyte microparticles,LMPs)作用于气道上皮细胞引起周期阻滞在G1期的机制通路。方法将人类正常气道上皮细胞培养到对数生长期时,20μg/ml的LMPs按照不同的时间0、4、8、16、20、24 h刺激气道上皮细胞,用RT-PCR方法检测P21、P27在mRNA水平的表达情况。20μg/ml的LMPs按照不同的时间0、4、8、16、24 h刺激气道上皮细胞,用Western blot方法检测P21、P27、Foxo1、p-Foxo1、AKT、p-AKT的蛋白表达情况。用免疫细胞化学技术检测Foxo1的核定位情况。结果与0 h对比,20μg/ml的LMPs作用于气道上皮细胞能使P21、P27的mRNA、蛋白水平显著升高(P<0.01),Foxo1蛋白水平无明显变化(P>0.05),p-Foxo1的蛋白水平表达减弱(P<0.01),AKT蛋白水平无明显变化(P>0.05),p-AKT蛋白水平表达减弱(P<0.01)。结论 LMPs作用于气道上皮细胞上调P21、P27蛋白的表达引起周期阻滞G1期,可能是通过AKT/Foxo1信号通路调节。