脱细胞骨基质复合材料的研究进展

切割伤、坠落伤、火器伤等导致的骨缺损患者不断增加,骨修复成为骨科发展研究中的热点问题之一。脱细胞骨基质(aceller bone matrix,ACBM)是对骨组织进行一系列物理和化学操作降低其免疫原性,保留了天然骨组织基本结构,在修复骨缺损的治疗中表现出良好的骨传导性、生物相容性和机械性能。但ACBM不能促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化,骨诱导性差,将ACBM与其他类型材料复合,制成具有成骨活性的复合材料,拓展其在骨组织工程中的应用。本文参考国内外文献,将ACBM复合的材料分为有机材料、无机材料、细胞因子组织细胞及多种材料复合四大部分,从临床研究角度分别阐述同ACBM复合形成的新型材料特性、优点、缺点和临床应用价值等,综述了近几年ACBM相关复合支架材料的研究进展。

等离子体处理胶原锚定PLGA/脱细胞骨基质骨软骨双层支架材料的制备和评估

目的:分别以胶原锚定方法修饰的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)为组织工程软骨支架材料,以脱细胞骨基质为组织工程骨支架材料,将二者结合制备出结合良好的组织工程骨软骨双层支架,并观察结构特征,以评估其作为组织工程化骨软骨复合体支架材料的可行性。方法:实验于2006-02/2007-02在解放军总医院骨科研究所完成。①支架的制备:以犬新鲜松质骨为原料,制备脱细胞骨基质作为骨支架材料;将脱细胞骨基质浸于盛有PLGA溶液的模具中,采用固-液相分离法结合致孔剂溶出法制备出多孔的PLGA/脱细胞骨基质双层支架,然后对PLGA支架部分进行等离子体处理和Ⅰ型胶原锚定修饰。得到的新型组织工程骨软骨双层支架的上层为多孔PLGA,下层为脱细胞骨基质。②支架的特征观察:对支架行扫描电镜检测,并采用乙醇置换法测定PLGA层孔隙率,采用北京亚林公司提供的扫描电镜图像分析系统测定PLGA层支架的平均孔径。结果:扫描电镜显示双层支架的PLGA部分具有良好的孔隙贯通结构,孔径为(211±33)μm,孔隙率为(95.0±1.5)%;脱细胞骨基质骨支架部分具有天然骨的孔径和空隙率;PLGA材料渗入骨支架部分,双层支架结合良好。结论:等离子体处理后胶原锚定修饰的PLGA/脱细胞骨基质双层支架具有良好的结构和孔隙率,结合良好,可作为支架载体应用于组织工程骨软骨复合体的构建。

牛脱细胞骨基质的生物力学特性及其黏附性

背景:脱细胞骨基质作为一种天然骨生物衍生材料,应用于骨组织工程支架有着其独特的优越性。目的:观察牛松质骨脱细胞后骨基质的生物力学特性、孔隙率及其黏附特性,探讨其作为组织工程骨天然支架材料的可行性。设计、时间及地点:力学实验采用随机对照观察,于2008-02/06在天津医科大学总医院骨科实验室完成。材料:新鲜牛股骨来自16月龄雄性蒙古牛,体质量350kg;新生24h内SD大鼠3只。方法:利用100g/LNaCl联合1%TritonX-100的方法制备脱细胞骨基质。脱细胞骨基质脱钙切片。利用ElectroForce3200力学试验仪对标本进行压力加载测试。利用新生SD大鼠颅骨传代培养第3代成骨细胞与脱细胞骨基质复合培养12h。空白对照组置于9g/LNaCl溶液。主要观察指标:①苏木精-伊红染色观察骨基质平均空隙直径及空隙率。②观察骨基质弹性强度、破坏载荷、弹性模量。③采用细胞计数法计算两者的黏附率。结果:①利用100g/LNaCl与1%TritonX-100联合可达到良好脱细胞效果,与对照组比较,脱细胞后实验组骨小梁无明显破坏。②所测得牛脱细胞骨细胞外基质空隙直径为(376.33±80.91)μm,空隙率为(70.15±2.98)%。③力学测试此脱细胞方法对骨基质力学特性无显著影响。④脱细胞骨基质与体外培养成骨细胞具有良好的黏附性能,黏附率为62.38%。结论:牛松质骨脱细胞骨基质较完整的去除了细胞的免疫原性,具有良好的骨组织工程支架材料力学性质,接近生理结构的空隙直径及孔隙率,黏附性能满足支架材料的要求。

人脱细胞骨复合骨髓基质细胞成骨活性的实验研究

目的 研究人脱细胞骨(HAB)复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测。方法 用15％的过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养。通过碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行复合培养。8d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。结果 人髂骨块内细胞清除干净,骨基质保存良好;诱导后的骨髓基质细胞ALP和OCN水平明显高于对照组(P<0.05);复合后的人脱细胞骨培养液中ALP和OCN检测呈阳性;骨髓基质细胞在HAB支架内附着紧密,生长良好。结论 人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料。

血管基质成分联合脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复桡骨缺损

背景:研究表明,复合使用人工组织工程骨材料和脱细胞骨基质做为骨缺损修复的支架材料,可以综合两者的优点。目的:进一步验证脂肪组织基质血管基质性成分联合脱细胞骨基质壳聚糖支架复合物修复兔桡骨缺损的安全性和生物相容性。方法:取38只新西兰大白兔,其中3只用于脂肪组织血管基质成分的制备,3只用于脱细胞骨基质的制备,32只分为实验组和对照组,采用Brownlow法制备桡骨缺损型,实验组移植血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架,对照组造模后不做任何处理。术后2,4个月分别进行一般情况和大体观察、X射线拍照、病理观察、Lane-Sandhu组织学评分。结果与结论:1术后2,4个月2组无感染现象,但实验组的活动量和愈合程度显著性好于对照组;2术后2个月实验组骨缺损部位的X射线影像结果有显著灰白色的高密度影,术后4个月与正常的桡骨骨组织相同,对照组骨不连接;3术后2,4个月实验组病理显示骨组织生长情况显著性的高于对照组,Lane-Sandhu组织学评分显著性的高于对照组(P<0.05);4结果说明,血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架修复兔桡骨缺损具有很好的安全性和生物相容性。

脱矿脱细胞骨基质环支架体外构建组织工程化椎间盘纤维环

目的:探计以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞体外培养构建组织工程化椎间盘纤维环的可行性。方法:取兔椎间盘纤维环细胞培养,应用甲苯胺蓝染色和Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴定。用纤维蛋白凝胶接种技术将兔椎间盘纤维环细胞接种到经脱矿脱细胞制备的骨基质环支架材料上,体外培养3个月。每月取培养的细胞支架复合体进行大体形态、HE染色光镜检查和扫描电镜观察,并用生化方法检测羟脯氨酸、氨基葡聚糖(GAG)、脱氧核糖核酸(DNA)含量;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫组化和蛋白质印迹方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:培养的第1代细胞甲苯胺蓝染色呈异染性,Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均可见阳性表达,表明培养的第1代细胞具有椎间盘纤维环细胞的表型特点。构建的复合体体外培养1、2、3个月时大体呈白色半透明样环状,有光泽,质韧,具有一定弹性,可扭曲;HE染色光镜下见支架孔洞被红染的组织填充,且空洞内的细胞密度逐渐增加;扫描电镜观察材料表面逐渐被组织填充;Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;培养2个月时复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量明显高于1个月时(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05),各时间点复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量均低于正常纤维环(P<0.05或<0.01);培养1个月时复合体可检测到Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达,2个月时与1个月时比较有显著性差异(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05)。结论:以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞构建的复合体在体外培养时,细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能,此复合体可被鉴定为类纤维环组织,用其构建组织工程化椎间盘纤维环可行。

碱性成纤维细胞生长因子复合脱细胞骨基质/壳聚糖支架修复骨缺损

背景:有研究显示,碱性成纤维细胞生长因子可促进间充质干细胞的增殖与成骨分化。目的:对比脱细胞骨基质/壳聚糖支架复合碱性成纤维细胞生长因子前后修复兔股骨缺损的能力。方法:采用融合共混与冷冻干燥法制备脱细胞骨基质/壳聚糖支架,采用浸渍法制备碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架。将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1分别接种于两种支架表面,以单独培养的细胞为对照,进行细胞增殖、细胞黏附与成骨基因检测。在36只6月龄新西兰大白兔双侧股骨远端制备直径5 mm的骨缺损模型,抽签法随机分3组,空白组不进行任何干预,单纯复合支架组、生长因子+复合支架组分别植入脱细胞骨基质/壳聚糖支架与碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架,进行骨缺损部位X射线片与组织学检查。结果与结论:①在培养的1-11 d内,碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架组的细胞增殖快于脱细胞骨基质/壳聚糖支架组(P<0.05),脱细胞骨基质/壳聚糖支架组快于对照组(P<0.05);②细胞与支架共培养4 d后,碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架组培养4,7 d的成骨基因Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白及Runx2 mRNA表达均高于脱细胞骨基质/壳聚糖支架组(P<0.05),培养7 d后的碱性磷酸酶mRNA表达高于脱细胞骨基质/壳聚糖支架组(P<0.05);③共培养7 d后的扫描电镜显示,两组支架均支持MC3T3-E1细胞的黏附;④动物实验X射线片显示,空白组术后12周时无明显的骨修复;单纯复合支架组术后8周时可见新骨生成,术后12周时可见明显新骨生成;细胞因子+复合支架组术后4周时即可见新骨生成,至术后12周时骨缺损部位几乎完全修复;⑤动物实验术后12周的缺损部位苏木精染色与Masson染色显示,空白组可见大量的纤维组织;两支架组可见大量的新骨生成,其中生长因子+复合支架组的新骨生成面积与成熟度高于单纯复合支架组;⑥结果表明,负载碱性成纤维细胞生长因子的脱细胞骨基质/壳聚糖复合支架是较为理想的骨组织修复材料,可促进骨形成。

新型脱细胞骨基质-壳聚糖骨组织工程支架的制备及性能评价

目的探寻新型脱细胞骨基质(Acellular Bone Extracellular Matrix,ABECM)材料及脱细胞骨基质-壳聚糖(Chitosan,CS)复合多孔支架的制备方法,并对其性能进行评价。方法采用Triton X-100、十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)的脱细胞方法对猪股骨进行脱细胞处理,应用溶液共混、冷冻干燥法制备脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架。对ABECM材料进行定性分析,观察ABECM-CS复合多孔支架的形态学、孔隙率、力学性能和细胞-支架复合培养的相容性。结果 ABECM材料HE染色、Hoechest33258荧光染色均无细胞残留,茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、骨形态发生蛋白-2抗体染色阳性。扫描电镜显示支架具有多孔结构,孔径50-200μm,孔隙率为(53.50±4.23)%,力学测试支架干燥状态纵向压缩模量为(33.23±14.45)MPa,支架湿润状态下的压缩模量为(2.27±1.13)MPa。细胞-支架复合培养相容性良好。结论制备的ABECM-CS复合多孔支架去细胞彻底,保留了脱细胞骨基质主要成分,具备合适的孔径和孔隙率,细胞相容性良好,是理想的骨组织工程支架。

内源性大麻素对体外培养的牛眼小梁细胞PGE2表达及细胞骨架的影响

目的:研究内源性大麻素N-花生四氢酸氨基乙醇(anan-damide,AEA)对体外培养的牛眼小梁细胞细胞骨架及PGE2表达的影响。方法:对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,并行鉴定。对传3代的牛眼小梁细胞分别施加AEA浓度分别为0,0.1,1.0,10μmol/L的无血清培养液,作用24h后提取细胞上清液,并将细胞置于倒置显微镜下摄像,计算机图像分析系统计算细胞面积。用ELISA法检测PGE2浓度的变化。结果:AEA可以产生明显的细胞舒张效应,呈浓度依赖性。而且在一定范围内可以成剂量依赖性的促进PGE2的表达。与对照组均有显著性差异(P<0.05)。结论:AEA可引起小梁细胞的舒张和促进PGE2的释放。

转化生长因子-β1对MC3T3-E1小鼠成骨细胞骨形成的影响

目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在成骨细胞骨形成中的负向调节作用及其可能作用机制。方法:离体培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞系,以10μg/L的甲状旁腺激素(PTH)或TGF-β1处理细胞6、12、24 h后,应用荧光定量PCR检测硬骨素(SOST)和TGF-β受体ALK5 mRNA表达变化;取对数生长期的MC3T3-E1细胞进行ALK5-siRNA转染,荧光定量PCR及Western blot法检测ALK5-siRNA转染对TGF-β1作用下MC3T3-E1细胞中SOST mRNA和Smad2/3蛋白表达的影响。结果:在10μg/L浓度的TGF-β1诱导下,MC3T3-E1细胞中SOST和ALK5 mRNA表达水平均较对照组升高(P<0.05),且表达水平均随着处理时间的延长而上调(P<0.05)。沉默ALK5可部分抑制TGF-β1诱导的SOST mRNA和Smad2/3蛋白表达上调(P<0.05)。结论:TGF-β1可通过激活Smad2/3信号通路上调SOST表达,从而抑制成骨细胞骨形成。

牛去细胞骨基质的生物相容性研究

目的研究新型骨修复材料牛去细胞基质骨的生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法对牛去细胞骨基质进行急性毒性实验、热源实验、溶血实验、兔肌肉内种植实验和兔桡骨骨缺损修复实验研究。结果牛去细胞骨基质无毒性、无热源性、不引起溶血反应,植入兔肌肉后逐渐发生生物降解并被纤维组织取代,兔骨缺损区植入后可被骨组织取代。结论牛去细胞骨基质具有良好的生物相容性,是理想的骨支架材料。

VEGF在脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损中的表达

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)在脱细胞骨基质(acellular bone matrix,ABM)复合富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)修复兔颅骨缺损时的表达及分布,探讨富血小板血浆促进成骨的机制。方法:雄性新西兰大白兔24只,体质量1.5～2.0kg。在兔颅骨两侧分别建立一个1cm×0.5cm全层骨缺损区,同时去除该区骨膜,注意勿伤及硬脑膜。随机选择一侧骨缺损作实验侧,植入复合PRP的ABM;另一侧为对照侧,仅植入ABM。术后第2、4、8、12周末分别处死6只兔取材。免疫组织化学法测定骨缺损修复区血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达;应用Image-proplus 5.0图像分析软件测量VEGF表达强度的灰度值。采用SSPS16.0软件包进行t检验。结果:术后2周,实验组VEGF呈强阳性表达,随后急剧下降,以后趋于平缓。对照组在术后2、4周呈阳性表达,以后平缓下降。两组相比,在第2、4周时差异均有显著性(P<0.05)。第8、12周时,2组表达差异无显著性。结论:VEGF在实验组早期阶段的强阳性表达,说明血管形成活跃。PRP促进骨修复的作用发生在植入后早期,启动了早期活跃的成骨。

脱细胞骨基质的立体构筑及TritonX-100残留量测定

目的制备骨组织工程的新型天然支架材料。方法取兔双侧胫骨,修整成片状,使用含3%TritonX-100及蛋白酶抑制剂的Tris-HCL的缓冲液洗脱掉骨片中的细胞成份。取脱钙后骨片行HE染色及阿利新蓝染色并用免疫组化方法检测骨片中纤维连接蛋白及层黏连蛋白;Mallory-Heidenhain染色测量骨陷窝形态;对骨片进行扫描电镜及透射电镜观察;使用反相高效液相色谱检测TritonX-100残留量。结果 HE、阿利新蓝染色见脱细胞骨基质胶原纤维排列规则,骨陷窝空虚;骨陷窝形态测量表明脱细胞骨基质的骨陷窝数量与正常骨的骨陷窝数量没有差异;免疫组织化学染色及免疫透射电镜均见纤维连接蛋白与层黏连蛋白存在于脱细胞骨基质和正常骨的骨陷窝周边处;TritonX-100残留量测定表明脱细胞骨基质最低检出极限为0.5μL/mL。结论脱细胞骨基质保持了骨的正常立体构筑,是一种新型的生物衍生材料,具有广阔的应用前景。

1,25双羟维生素D_3对成骨样细胞骨架和基因表达的影响

用荧光免疫法研究了１，２５双羟基维生素Ｄ３对大鼠成骨样细胞（ＲＯＳ１７／２．８）细胞骨架的影响和用斑点杂交技术研究了１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对人成骨样细胞（ＯＳ－７３２）基因表达的影响。结果表明：在１０－７ｍｏｌ／Ｌ１，２５（ＯＨ）２Ｄ３连续作用４ｄ后，大鼠ＲＯＳ１７／２．８细胞的微管蛋白和波形纤维蛋白明显改善，纤粘蛋白荧光明显增强。而在１，２５（ＯＨ）２Ｄ３作用前后ＯＳ－７３２细胞ｃ－ｍｙｃ和ｍｅｔＤ基因均处于高度活跃表达状态。本文还讨论了细胞分化与细胞骨架及基因表达的关系。

版纳小型猪脱细胞骨基质的抗原检测及力学性状

制备版纳小型猪脱细胞骨基质,进行组织学和生物力学观察,并进行了异种抗原-αga l表达的检测,结果表明经脱细胞处理后,去除了骨组织的细胞成分,同时消除了抗原性,力学性质上与正常对照无明显差异,可以作为一种合适的骨组织工程支架材料。

脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损的实验研究

目的研究脱细胞骨基质（ABM）复合富血小板血浆（PRP）修复兔颅骨缺损的可行性及机制。方法雄性新西兰大白兔24只，体质量1．5～2．0kg。在兔颅骨两侧分别建立1cm×0．5cm的全层骨缺损区，去除该区骨膜。随机选择一侧作实验侧，植入复合PRP的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。术后第2、4、8、12周分别处死兔6只并取材，观察两侧颅骨缺损修复愈合情况。结果所有实验动物均未发生明显炎症和排异反应。随着时间的延长。两侧颅骨缺损区都有不同程度的成骨，新生骨量呈增加趋势。术后第12周，实验侧ABM颗粒已完全降解，骨髓腔改建完成，缺损区基本达到骨性愈合；对照侧仍有较大的ABM颗粒未降解，缺损中央部位仍有未愈合区域，有骨髓腔形成。结论ABM是良好的骨移植替代材料，PRP具有促进成骨作用，能加速骨缺损的修复。

脱细胞骨软骨支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外的复合

目的测定脱细胞和脱钙处理的脱细胞骨软骨支架的细胞相容性及该支架与软骨细胞体外复合培养的生物学特性和黏附关系,以探讨脱细胞骨软骨支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法采用自制脱细胞骨软骨支架与软骨细胞体外复合培养,用细胞增殖度法测定脱细胞骨软骨支架的细胞相容性,并行电镜观察其相互黏附关系。结果脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验中,软骨细胞可贴附于材料上生长增殖,并分泌细胞外基质。结论细胞增殖实验显示脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验显示脱细胞骨软骨支架可与软骨细胞良好复合,适于软骨细胞贴附生长。

脱细胞骨软骨支架的制备及形态学观察

目的:探讨脱细胞骨软骨支架制备的可行性,为关节软骨组织工程提供新的支架材料。方法:3月龄雄性新西兰大白兔,取膝关节髌股关节面的股骨侧,切取4mm×4mm×3mm大小(长×宽×深)骨软骨块,用去垢剂-酶法对骨软骨组织块进行脱细胞脱钙处理,冻干机冻干,制备脱细胞骨软骨支架,并对其进行形态学观察。结果:脱细胞骨软骨支架呈半透明状,弹性良好,组织学评价提示细胞成分已完全祛去,保留了纤维支架。结论:去垢剂-酶法可以祛去骨软骨块中的细胞成分,成为带有空隙的支架材料。

肾主骨理论与骨髓间充质干细胞骨向分化关系之探讨

文章从中国传统医学"肾主骨"理论和"骨髓间充质干细胞骨向分化"两个方面在基本理论、实验研究以及临床实践等多角度去探讨相互间之关系,希冀为进一步的科研工作提供一些思路。

脱细胞骨基质研究进展

因严重创伤及骨肿瘤所致的骨不连、骨缺损严重影响人体生活质量甚至威胁生命,一直是骨科医生的难题.中国每年有数百万人面临骨不连、骨缺损痛苦.目前常用的治疗方法主要是自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植等.这些方法各有优缺点,难以满足临床上修复各种骨缺损的需要.也就是说,目前还没有十分理想的骨移植材料.