miR-185在弥漫大B细胞淋巴瘤细胞黏附介导耐药中的作用

目的探讨miR-185在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)细胞黏附介导耐药(cell adhesion mediated-drug resistance,CAM-DR)中的作用。方法采用qPCR法分析人DLBCL细胞株OCI-Ly8、OCI-Ly10中miR-185的表达。应用Western blot法检测人DLBCL细胞株OCI-Ly8、OCI-Ly10中PYK2和pPYK2(Tyr402)的表达状态。在人胚肾HEK-293T细胞中利用荧光素酶报告基因实验分析miR-185是否可靶向抑制PYK2。台盼蓝拒染实验分析miR-185和PYK2对CAM-DR的影响。结果qPCR检测发现,OCI-Ly8与纤连蛋白(fibronectin,FN)黏附培养组与悬浮培养组中miR-185的表达:(0.17±0.07)vs(1.01±0.11)(t=9.05,P<0.001);OCI-Ly10细胞与FN黏附培养组与悬浮培养组中miR-185的表达:(0.35±0.15)vs(1.01±0.15)(t=4.50,P=0.011);提示OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可下调miR-185的表达。Western blot法检测发现,OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平。在悬浮及FN黏附培养状态下,敲低miR-185可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平。在HEK-293T细胞中过表达miR-185后,3′非翻译区(untranslated region,UTR)空载体组与野生型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性:(1.00±0.06)vs(0.49±0.04)(t=9.54,P<0.001);3′UTR空载体组与突变型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性:(1.00±0.06)vs(0.94±0.06)(t=1.01,P=0.371);提示miR-185可靶向抑制PYK2。台盼蓝拒染实验显示,OCI-Ly8细胞黏附培养状态下shCtrl(对照慢病毒)+Doxo(多柔比星)组与sh-miR-185(miR-185下调慢病毒)+Doxo组细胞死亡比例:(39.43±3.94)%vs(26.93±6.25)%(t=2.93,P=0.043);OCI-Ly10细胞黏附培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例:(43.67±9.66)%vs(16.10±3.42)%(t=4.66,P=0.009)。OCI-Ly8细胞黏附培养状态下Ctrl(对照慢病毒)+Doxo组与PYK2(PYK2过表达慢病毒)+Doxo组细胞死亡比例:(37.70±7.64)%vs(20.07±7.59)%(t=2.84,P=0.047);OCI-Ly10细胞黏附培养状态下Ctrl+Doxo组与PYK2+Doxo组细胞死亡比例:(34.00±5.46)%vs(14.37±3.46)%(t=5.26,P=0.006)。细胞黏附介导的miR-185下调和PYK2表达增加,可促进CAM-DR。OCI-Ly8细胞黏附培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例:(25.03±3.30)%vs(39.37±5.06)%(t=4.11,P=0.015);OCI-Ly10细胞黏附培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例:(27.50±6.52)%vs(47.53±9.43)%(t=3.03,P=0.039);PF-562271可抑制miR-185下调介导的CAM-DR表型。结论DLBCL细胞与FN黏附培养可下调miR-185表达,并上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平;在DLBCL中miR-185可靶向抑制PYK2,细胞黏附介导的miR-185下调可能通过诱导PYK2表达增加促进CAM-DR;PF-562271可抑制miR-185下调介导的CAM-DR。

STAT1在多发性骨髓瘤增殖及细胞黏附介导耐药中的作用

目的分析信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)对多发性骨髓瘤增殖及细胞黏附介导的耐药(cell adhesion-mediated drug resistance,CAM-DR)影响。方法H929及MM.1S细胞感染STAT1过表达慢病毒(Lv-STAT1)或对照慢病毒(Lv-Ctrl),CCK-8法分析过表达STAT1对H929及MM.1S细胞增殖的影响;CCK-8实验、台盼蓝拒染实验分析过表达STAT1对CAM-DR的影响;Western blot分析过表达STAT1对IRF2、BCL-2、Bax、Cleaved Caspase-3表达的影响。结果与对照组相比,过表达STAT1可显著增强H929及MM.1S细胞的增殖能力(H929细胞48 h:t=5.78,P=0.004;H929细胞72 h:t=4.97,P=0.008;MM.1S细胞48 h:t=3.27,P=0.03;MM.1S细胞72 h:t=5.01,P=0.007)。与对照组相比,过表达STAT1可显著降低H929及MM.1S细胞对多柔比星的敏感性。与对照组相比,过表达STAT1可显著降低悬浮及黏附培养状态下多柔比星诱导的细胞死亡(H929悬浮:t=8.43,P=0.001;H929黏附:t=4.63,P=0.009;MM.1S悬浮:t=3.94,P=0.017;MM.1S黏附:t=3.91,P=0.017)。过表达STAT1可增强H929以及MM.1S细胞中IRF2、BCL-2的蛋白表达水平,并抑制Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。结论STAT1异常活化可促进多发性骨髓瘤细胞的增殖和CAM-DR,其可能通过激活STAT1-IRF2信号通路发挥作用。

雷帕霉素逆转骨髓瘤U266细胞黏附介导的耐药

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)对骨髓瘤U266细胞的黏附作用的影响及因黏附介导的阿霉素耐药的影响。方法采用结晶紫染色法检测U266细胞与纤连蛋白(Fibronectin,FN)的黏附作用;MTT实验检测RAPA对骨髓瘤细胞因黏附介导的阿霉素耐药的影响。结果U266细胞与FN黏附1、6、12h,其黏附率分别为(35.13±4.31)%、(43.65±3.86)%和(60.38±5.27)%;用160nmol·L^(-1)RAPA处理1、6、12h后黏附率分别降为(22.14±6.13)%、(21.99±5.68)%和(27.76±4.91)%,组间比较差异显著(P<0.05);当阿霉素作用时,FN黏附组细胞IC50值〔(3.16±0.29)mol·L^(-1)〕显著高于BSA组〔(0.62±0.19)mol·L^(-1)〕(P<0.05);FN联合RAPA组IC50值〔(0.65±0.31)mol·L^(-1)〕显著低于FN组(P<0.05),但与BSA联合RAPA组〔(0.58±0.22)mol·L^(-1)〕相比无显著性差异(P>0.05),但却低于FN组(P<0.05)。结论RAPA能降低U266细胞与FN的黏附率和逆转黏附介导的阿霉素耐药。

酪氨酸激酶抑制剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性

为了探讨酪氨酸激酶抑制剂STI571对RPMI8226细胞黏附、黏附诱导耐药以及靶细胞Rac1mRNA表达的影响,本研究采用结晶紫染色法分析了RPMI8226细胞与纤连蛋白(fibronectin,FN)的黏附率,用MTT法检测瘤细胞的增殖性,并用半定量RT-PCR研究Rac1mRNA水平的变化。结果显示:RPMI8226细胞与FN黏附1、6、12小时,其黏附率分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%;用20μmol/LSTI571处理1、6、12小时后黏附率分别降为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%;组间差异显著(P<0.05);阿霉素作用后,FN黏附组细胞IC50值[(1.46±0.04)μmol/L]显著高于BSA组[(0.78±0.03)μmol/L](P<0.05);FN联合STI571组IC50值[(0.81±0.05)μmol/L]与BSA联合STI571组[(0.74±0.02)μmol/L]相比无显著性差异(P>0.05),但却低于FN组(P<0.05);半定量RT-PCR显示,Rac1mRNA水平在20μmol/LSTI571处理14小时后明显下降。结论:STI571能降低RPMI8226细胞与FN的黏附率、逆转黏附介导的阿霉素耐药,并且可以下调其Rac1mRNA水平。

EGFR/CerbB-2/MAPK介导乳腺癌三苯氧胺耐药细胞的生长

目的探讨乳腺癌三苯氧胺(TAM)获得性抵抗细胞的生长调节途径及三苯氧胺(TAM)获得性抵抗的发生机制。方法构建TAM抵抗的人乳腺癌细胞系(MCF-7/TAMR),RT-PCR、Westernblot及免疫细胞化学方法比较MCF-7/TAMR与MCF-7/WT细胞系中EGFR(CerbB-1)、CerbB-2、CerbB-3、CerbB-4mRNA及蛋白表达的不同。结果与MCF-7/WT细胞相比,MCF-7/TAMR细胞中表皮生长因子受体EGFR的mRNA增加6倍(P<0.05),蛋白增加3倍(P<0.05);CerbB-2的mRNA增加3倍(P<0.05),蛋白增加1.5倍(P<0.05);CerbB-3在两种细胞中的表达相似;CerbB-4未能检测到;MCF-7/TAMR细胞中MAPK活化水平增高;基础条件下,MCF-7/TAMR细胞中磷酸化的EGFR/CerbB-2,EGFR/CerbB-3异二聚体与细胞外信号调节激酶磷酸化水平增高有关;Herceptin处理MCF-7/TAMR细胞,阻滞了CerbB-2受体异二聚体的形成及磷酸化,降低了细胞外信号调节激酶的活性,明显抑制了细胞的生长。结论表皮生长因子受体特异性配体的自分泌释放作用诱导EGFR/CerbB-2二聚体形成及下游细胞外信号调节激酶(MAPK)的活化引起MCF-7/TAMR细胞的生长。

逆病毒载体介导双耐药基因在脐血CD34^+细胞中的表达和抗性研究

为探讨转染醛脱氢酶基因(ALDH1)和多药耐药基因(MDR1)的人脐血CD34^+细胞能否同时增强对活性环磷酰胺(4-HC)和MDR1基因靶药的抗性,构建了同时含ALDH1和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na-ALDH1-IRES-MDR1,经Lipofect-AMINE介导转染GP+E86和PA317包装细胞,采用含长春新碱(VCR)和4-HC的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP+E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染,获得PA317重组病毒生产细胞(最高滴度达5.6×10~5CFU/ml),将含ALDH1和MDR1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染人脐血CD34^+细胞,用PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot、FACS和MTT等方法检测外源ALDH1与MDR1基因在CD34^+细胞中的转移和表达。结果显示:逆转录病毒载体介导的双耐药基因已经整合入转染靶细胞基因组并获得有效表达,同时传递不同的耐药表型。经双耐药基因修饰的脐血CD34^+细胞对4-HC和VCR药物同时产生抗性,其IC_(50)值分别比未转染细胞高4倍和7.2倍,本研究为开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础。

双特异抗体介导活化T细胞杀灭耐药肿瘤细胞

原发性和继发性的肿瘤细胞对化疗药物的抵抗是肿瘤化学治疗失败的主要因素，目前已用离子通道阻断剂试图逆转肿瘤细胞由耐药变为敏感，但临床应用产生的效果甚微，因此需要另辟蹊径。本文报告双特异性抗体能够介导T细胞杀灭耐药的肿瘤细胞。

表皮葡萄球菌细胞间脂多糖黏附素的表达与耐药特征的相关性

目的 :探讨表皮葡萄球菌细胞间脂多糖黏附素(polysacchatide intercellular adhesion,PIA)的表达与细菌耐药特征的相关性。方法:收集分离临床标本中的表皮葡萄球菌,通过使用刚果红琼脂平皿检测PIA,考察该菌生物膜的形成能力;按照结果分为PIA阳性组和阴性组,选取八种抗生素,应用K-B琼脂扩散法进行药物敏感试验并计算耐药率,同时探讨两者之间的关系。结果 :临床标本中分离到的表皮葡萄球菌对青霉素G有极高的耐药率(100%),对甲氧西林、红霉素、克林霉素、环丙沙星有较高的耐药率(40.5%～96.8%),对利福平耐药率较低(2.4%～3.1%),而对万古霉素和替考拉宁耐药率极低(0%);除对利福平外,PIA阳性和阴性菌株对其他四组抗生素的耐药率均有显著性差异(P<0.05)。结论 :生物膜形成能力强的表皮葡萄球菌通常对抗生素的耐药性更高(对利福平除外),推荐使用利福平作为治疗和预防治疗植入物生物膜感染的联合用药。

上皮细胞黏附分子增强细胞间紧密连接促进乳腺癌细胞耐药

乳腺癌是致死率很高的恶性肿瘤,由ABCG2(ATP-binding cassette G2)介导的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致其化疗失败的重要原因,探讨ABCG2介导的耐药机制并探寻其关键分子是当前亟待解决的难题。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)参与多种肿瘤耐药,且与乳腺癌MDR密切相关,但它在ABCG2介导的乳腺癌耐药中的作用尚未阐明。本研究目的在于探究EpCAM对于ABCG2介导的乳腺癌细胞的多药耐药的调节作用及其机制。CCK8细胞毒性结果证实,相对于人乳腺癌药物敏感株MCF-7,耐药株MCF-7/MX对米托蒽醌(mitoxantrone,MX)的耐药性显著增强;Western印迹结果显示,与MCF-7相比,MCF-7/MX细胞中ABCG2高表达,EpCAM表达上调。siRNA法敲低MCF-7/MX细胞中EpCAM可下调其ABCG2表达,并恢复对MX的敏感性。倒置显微镜观察细胞形态,发现敲低EpCAM可减少MCF-7/MX细胞间连接。免疫荧光双染法观察到EpCAM与密封蛋白1(claudin 1)在MCF-7/MX细胞共定位;进一步Western印迹结果表明,敲低EpCAM减少MCF-7/MX细胞中密封蛋白1表达。综上所述,EpCAM可能通过与密封蛋白1相互作用,增强细胞间紧密连接,促进ABCG2介导的乳腺癌多药耐药。

β-TrCP1在非霍奇金淋巴瘤细胞黏附耐药中的作用

目的:探讨β转导重复包含蛋白(β-transducin repeat containing protein 1,β-TrCP1)对非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)细胞黏附耐药性的影响。方法:采用Western Blot法检测NHL细胞黏附到骨髓基质细胞后β-TrCP1的表达水平,钙黄绿素检测法检测β-TrCP1 对NHL 细胞黏附率的影响,CCK8、TUNEL 检测干扰β-TrCP1 后对NHL 细胞耐药性的影响。结果:β-TrCP1 蛋白在NHL 细胞黏附到骨髓基质细胞后表达升高,且干扰β-TrCP1 的表达能明显下调NHL 细胞的黏附率。将NHL 细胞黏附到骨髓基质细胞并加入米托蒽醌后,干扰β-TrCP1 的表达能明显抑制NHL 细胞活性并增加凋亡细胞数量。结论:干扰β-TrCP1 能抑制NHL 细胞黏附介导的耐药。

骨髓间充质干细胞介导白血病耐药的研究进展

白血病是儿童最常见的恶性肿瘤,占儿童癌症病例的30%~40%。随着当前化学药物治疗方案的改进,儿童急性白血病预后有了显著改善。然而,临床上仍有相当一部分患者对化疗药物产生耐药,耐药性的产生是白血病化疗失败的常见原因。近年来,越来越多的研究表明,骨髓间充质干细胞能调节白血病细胞生存的微环境,通过细胞黏附、可溶性细胞因子、免疫逃逸等机制保护白血病细胞免受化疗药物诱导的凋亡。令人惋惜的是,其具体的发生机制仍未明确,亟待进一步探究。本文重点阐述骨髓间充质干细胞介导白血病耐药的研究现状及相关机制,为制定新的治疗策略提供思路。

RNA干扰细胞黏附分子L1表达逆转胶质瘤U251细胞多药耐药

背景与目的:细胞黏附分子L1(cell adhesion molecule L1,L1CAM)是一种跨膜黏附蛋白,在神经系统发育及肿瘤发生中发挥重要作用。本研究运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制L1CAM表达,并探讨其对胶质瘤U251细胞多药耐药的逆转作用及相关分子机制。方法:将针对L1CAM的小干扰RNA(siL1)和阴性对照siRNA(siCon)转染人胶质瘤U251细胞。实验分3组:空白对照组(胶质瘤U251细胞)、阴性对照组(转染siCon的胶质瘤U251细胞)、实验组(转染siL1的胶质瘤U251细胞)。蛋白质印迹法(Western blotting)检测U251细胞中L1CAM、MRP1、DAKT及pERK1/2等蛋白表达。细胞增殖实验检测L1CAM对顺铂(cisplatin)和PI3K/AKT抑制剂LY294002抑制U251细胞增殖的影响。免疫荧光染色法检测抑制L1CAM表达对U251细胞系中AKT磷酸化情况的影响。结果:实验组L1CAM、DAKT、pERK1/2蛋白表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),但实验组多药耐药蛋白MRP1表达量以及Bcl-2α/Bax与阴性对照组和空白对照组相比无明显变化。实验组顺铂和LY294002对U251细胞增殖的抑制率高于阴性对照组和空白对照组,提示抑制L1CAM表达后细胞对顺铂和LY294002的敏感性增加。免疫荧光结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞内AKT磷酸化信号明显降低。结论:RNAi抑制L1CAM表达能增强顺铂和LY294002对U251细胞增殖的抑制作用,并可抑制PI3K/AKT和MAPK信号激活,一定程度上可逆转胶质瘤细胞的多药耐药性。

培美曲塞敏感与耐药胰腺癌细胞株生物学行为观察及机制探讨

目的观察胰腺癌培美曲塞敏感株Patu8988和耐药株Patu8988/P生物学行为的差异,并探讨其可能的机制。方法取对数生长期的Patu8988、Patu8988/P细胞,分别采用双层软琼脂实验检测细胞集落生成能力、流式细胞仪检测细胞周期分布、Transwell小室检测细胞侵袭及转移能力,采用RT-RCR法、流式细胞仪检测胰腺癌细胞中的CD44mRNA及其蛋白。结果与Patu8988细胞比较,Patu8988/P细胞的克隆形成能力增强,G1期的细胞比例增加,S期减少,而侵袭转移能力减弱,CD44mRNA及其蛋白均表达增高,P均<0.05。结论 Patu8988/P、Patu8988细胞的生物学行为有不同程度的差异,主要表现在前者集落生成能力增强,侵袭、转移能力减弱等;CD44表达升高可能是造成这种差异的原因之一。

细胞粘附在结肠癌细胞系SW480多药耐药表型中的作用

目的探讨细胞粘附在结肠癌细胞系SW 480多药耐药表型中的作用。方法通过细胞粘附实验、四甲基偶氮唑盐实验(MTT法)、细胞内阿霉素的蓄积和潴留及Annexin V/PI染色法检测凋亡等检测粘附于层粘连蛋白(LN)的结肠癌细胞系SW 480的多药耐药性的改变。结果粘附于LN的SW 480细胞对化疗药物敏感性显著下降,化疗药物的IC50均显著升高,化疗药物诱导的凋亡指数明显减少;细胞内阿霉素的蓄积和潴留均明显减少,药物泵出率显著增加(P<0.05)。结论结肠癌细胞SW 480与LN粘附后,可能提高了对药物转运的能力,导致化疗药物在肿瘤细胞内蓄积的减少;通过提高抗凋亡的能力,逃避化疗药物诱导的凋亡。

导入MDR1的脐血有核细胞对化疗药物耐受性的体外研究

目的探讨一种抵抗大剂量化疗药物的方法。方法通过腺病毒载体介导使多药耐药(MultidrupResistance,MDR1)基因转染入脐血有核细胞(CordBloodNucleateCells,CBNC),提高其对化疗药物的耐受性。结果转染MDR1基因的CBNC对化疗药物有明显的抵抗性(P<0.01,与未转染的CBNC相比)。结论通过腺病毒介导的MDR1基因转染CBNC能有效的抵抗化疗药物对其的损伤,从而有望对临床肿瘤的大剂量化疗提供一种有效的防护细胞损伤的方法,提高化疗效果。