体外连续传代培养对生物工程细胞CHO凋亡的影响

采用Annexin V-FITC/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻、JC-1染色法检测线粒体膜电位、底物切割法检测Caspase-3及Caspase-8酶活性等4个指标来评估连续传代培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的凋亡情况。结果表明,随着连续传代培养代次的增加,CHO细胞发生内部凋亡途径介导的凋亡,同时对凋亡诱导剂的反应更为敏感。因此,可以采用凋亡指标来监测细胞状态,从而提高基因工程蛋白的生产效率及化学品毒理学评价的准确性。

神经肽Y基因在哺乳动物细胞CHO中的稳定表达

以ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ介导将ｐＲｃ／ＣＭＶＮＰＹ质粒转染入ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛选及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ和ＨＰＬＣ检测，得到稳定表达神经肽Ｙ（ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ，ＮＰＹ）的细胞株，表达量为２～１０ｎｇ／（ｍｌ·１０７细胞）；表达时相分析结果显示转染细胞在转染后第４天表达量最高。

稳定表达细胞色素P4502B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立及鉴定

目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5/FRT-CYP2B6重组质粒转染至Flp-In^(TM)CHO空载体组细胞和Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)及荧光素酶实验检测转染细胞中CYP2B6 mRNA水平、蛋白表达水平及活性,用四氮唑盐(MTS)测定转染CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞对环磷酰胺的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO组和Flp-In^(TM)CHO空载体组相比,Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中CYP2B6的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)、酶活性显著增加(P<0.001),对环磷酰胺的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建稳定表达CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系,为研究药物代谢和筛选毒性药物提供工具。

恒稳磁场辅助CHO细胞培养和表达特性研究

以中国仓鼠卵巢细胞为宿主细胞构建重组表达细胞用以表达单克隆抗体,已经被广泛应用于生物制药领域。物理调控是影响细胞增殖和表达的重要方式,但针对恒稳磁场暴露下的CHO细胞培养及其抗体表达还鲜有报道。基于此,文章利用3.0 mT恒稳磁场,在37℃、8%CO_(2)环境下对CHO细胞进行克隆培养,通过克隆扩增筛选、蛋白表达及分析、拷贝数监测等手段来评估其对抗体表达的影响。结果表明,与对照组相比,在3.0 mT磁场环境下,单克隆形成数量增加了13.24%,细胞数量显著增多,单克隆抗体表达水平提升53.2%,克隆筛选周期缩短4~5 d。此外,在亚克隆筛选中,亚克隆的细胞数量和抗体表达在磁场暴露下略有增加,而抗体表达、蛋白质量和基因拷贝数在传代后均无显著变化,表明磁场暴露环境中培养的重组CHO细胞具有稳定的性质。该研究结果有望为未来CHO细胞的大规模培养以及磁场暴露下的高效生产抗体研究提供参考。

锌离子对CHO细胞IgG2抗体表达及二硫键异构体分布的影响

目的:研究Zn^(2+)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)生长、IgG2表达及其二硫键异构体分布的影响。方法:补料分批培养外分泌IgG2的CHO细胞株中,分别添加不同浓度的葡萄糖酸锌,每天监测细胞密度以及活率;培养14 d后离心除细胞得上清液,通过生化分析仪测定上清液中IgG2含量,之后应用蛋白A磁珠亲和得到IgG2纯化样品,非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测IgG2二硫键异构体分布。结果:25~200μmol/L浓度条件下,Zn^(2+)对于CHO细胞生长,活率维持以及IgG2抗体的表达均有一定的负面影响,并与Zn^(2+)浓度具有负相关性;而Zn^(2+)的添加能够显著提高IgG2二硫键异构体中IgG2-B亚型的比例,下调IgG2-A和IgG2-A/B两种亚型比例。其中100μmol/L Zn^(2+)效果最明显,IgG2-B比例提高近10个百分点。结论:Zn^(2+)能够抑制CHO细胞生长以及IgG2表达,同时Zn^(2+)对二硫键异构体的调控至关重要。

接种重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)偶合带状疱疹性神经痛1例

采用流行病学方法提取受种者、疫苗生产企业和接种方相关资料,对接种重组带状疱疹(HZ)疫苗(CHO细胞)后出现的1例HZ性神经痛(PHN)病例开展调查,评估PHN与疫苗接种的因果关系,并为防止类似事件提供科学依据。根据疫苗接种与临床表现的时间和因果关联等确定所患PHN与疫苗无因果关系,不属于预防接种异常反应,属偶合症。重组HZ疫苗是目前预防HZ安全、有效的手段。

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合,克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中,包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞,经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选,基因水平和蛋白水平表达验证,成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系,为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。

慢病毒介导的稳定表达鸭干扰素-γ细胞株的构建

干扰素-γ是一种具有抗病毒活性和免疫调节能力的细胞因子之一。为了建立稳定表达鸭干扰素-γ(duIFN-γ)的细胞系,本研究优化并合成了duIFN-γ基因,插入到慢病毒表达载体plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro,获得重组质粒plenti-IFN,将plenti-IFN与辅助质粒共转染包装细胞293T,筛选出了携带duIFN-γ基因的重组慢病毒rlenti-IFN,将该病毒感染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,利用有限稀释法和抗性加压筛选法,筛选出了30个具有嘌呤霉素抗性基因的单克隆细胞系。利用RT-qPCR荧光定量法对这些单克隆细胞的duIFN-γ mRNA水平进行检测,筛选出了duIFN-γ mRNA水平最高的1个单克隆细胞,对其进行扩大培养,获得了1株稳定细胞系。Western blot检测结果表明,duIFN-γ稳定表达于该细胞系中。本研究获得了1株稳定表达duIFN-γ蛋白的细胞系,该研究为开展duIFN-γ生物学功能研究、建立duIFN-γ检测方法及生产廉价鸭(禽)用干扰素奠定了基础。

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。

不同亚型CHO宿主细胞对抗体表达的影响

CHO细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。其中,CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S是最常见的3种亚型。虽然这些亚型是从共同的原始CHO细胞分离出来的,但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和保存,使得CHO细胞积累了大量变异,导致宿主细胞应用于抗体药生产时会在细胞生长状态、抗体表达量及以糖型为代表的质量属性方面表现出较大差异。综述了CHO细胞不同亚型的染色体差异、生长状态、表达差异以及糖型差异,以期为抗体药物研发中宿主细胞的选择提供参考。

细胞色素P450 3A4基因C239S突变体稳定表达Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立

目的构建稳定表达细胞色素P450家族3亚家族A成员4(CYP3A4)的C239S突变体(CYP3A4-C239S)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法使用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP3A4-C239S突变型重组质粒和pcDNA5/FRT-空质粒转染至Flp-In TM CHO细胞,潮霉素B(500 g/L)进行稳定筛选,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中CYP3A4-C239S的mRNA和蛋白表达,采用黄曲霉素B1(AFB1)细胞毒性实验检测细胞活性。结果与Flp-In^(TM)CHO-空质粒组相比,Flp-In^(TM)CHO-3A4-C239S组的CYP3A4-C239S mRNA和蛋白表达水平均显著增加(P<0.001),AFB1细胞毒性实验显示,CYP3A4-C239S细胞组对AFB1的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建了稳定表达CYP3A4-C239S的Flp-In^(TM)CHO细胞系,且为后续研究CYP3A4突变对药物代谢的影响支撑基础。

过量表达CHO细胞内源性糖基化酶对抗体五聚甘露糖修饰的影响

目的研究CHO K1细胞内源性糖基化酶对细胞的生长代谢以及抗体中五聚甘露糖(Man5)水平的影响。方法构建含有抗体基因、糖基化酶基因共转染的CHO K1稳定细胞株以及空载细胞株,检测细胞群和克隆阶段的抗体滴度、Man5水平,使用RT-qPCR的方法检测过表达基因的转录水平,并分析单克隆细胞基因转录水平与Man5含量的相关性。结果研究显示,过表达糖基化酶基因后对细胞生长代谢的影响相对较小,糖基化酶基因单独过表达对降低蛋白中的Man5含量没有效果。将基因Man2a2和Mgat2组合过表达之后,可以将Man5的水平降低70%~80%,两个基因的转录水平都较高的情况下对降低Man5含量可以起到更加显著的作用。结论糖基化酶基因Man2a2和Mgat2组合过表达可以显著降低抗体蛋白中的Man5水平。

山药提取物对CHO细胞生长及抗体表达的影响

探究山药提取物(Dioscorea oppsita extract,DOE)对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)生长及抗体表达的影响。通过添加不同浓度的DOE,采用流加培养的方式,分别测定细胞密度、细胞活力、细胞上清中抗体表达量、单抗体含量,检测抗体电荷变体并分析抗体的糖基组成及相对含量和蛋白相对结合活性,以及在细胞生长过程中测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。结果表明,5 mg·mL^(-1)DOE可以明显地促进CHO细胞的生长,提高活细胞密度、细胞活力和SOD活性并降低MDA含量、提高细胞内抗体和单抗含量。添加DOE在一定程度上能够改变抗体某些糖型含量,且随着DOE浓度的增加,糖型G0F和Man5相对含量呈现先降低后缓慢增加的趋势,G1F糖型含量则逐渐升高,G0则变化较小相对较稳定。添加DOE后,抗体中酸性电荷变体、主峰和碱性电荷变体含量均不存在统计学差异(P>0.05),其抗体相对结合活性均保持在参比品的102%~135%之间,DOE不影响抗体的结合活性。综上所述DOE在细胞培养过程中对细胞的生长、抗体的表达方面发挥着重要作用,添加5 mg·mL^(-1)DOE对细胞生长的促进作用和抗体表达效果最佳,研究结果为中药提取物对CHO细胞的生长及抗体表达方面的研究提供了参考。

水解物对CHO细胞培养工艺的影响

目的对比3种水解物对CHO悬浮培养细胞生长的影响,以及对细胞分泌表达的抗体质量的影响。方法应用3种不同来源的水解物,采用摇瓶培养CHO细胞,观察培养过程中细胞密度、活性和代谢产物的变化,以及抗体质量的影响。结果水解物对CHO生长无显著促进作用、但可大幅度提高抗体产量;对抗体糖型无显著影响,可显著影响抗体电荷分布。结论3种水解物中,Preteose peptone和Phytone peptone对CHO有很好的促进作用。但Preteose peptone含有动物然产分,随着各国药监对动物来源成分监管制度的严格,将进一步限制Preteose peptone的应用,因此Phytone peptone具有优势。

利用CHO(dhfr^-)细胞高效表达GM-CSFFc_(γ2)^-融合蛋白

目的 利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )高效表达融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。方法 利用脂质体基因转染技术 ,把含有融合基因GM -CSF Fcγ2-的真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2 -dhfr共转染二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )中。用G4 18和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷 )双筛选 ,获得dhfr +neo +双表型阳性的细胞克隆。取表达产量最高的克隆进行亚克隆 ,并行MTX加压筛选 ,以提高表达量。用RT -PCR、ELISA和Westernblot对表达产物进行鉴定并行MTT法检测表达蛋白的生物学活性。结果 成功地表达出了具有GM -CSF生物学活性的融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。结论 该方法可行 ,表达量达到 15μg ml。

APS作为重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗佐剂的安全性及免疫效果

目的 探讨黄芪多糖（APS）作为重组（CHO细胞）乙肝疫苗免疫佐剂的可行性。方法APS与重组（CHO细胞）乙肝病毒表面抗原（HBsAg）混合制成疫苗,进行了动物毒性试验、过敏试验及效力试验。结果 该佐剂毒性轻微,无过敏反应,同一剂量组动物血清抗-HBs阳转率高于Al（OH）3对照组。结论APS是一种很有潜力的疫苗佐剂。

通过载体DHFR基因的弱化提高抗体在CHO细胞中的表达

目的:提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株(CHO/DHFR-)中表达的产量。方法:对表达载体中DHFR基因表达调控序列进行一系列的删除突变和点突变后,构建不同的嵌合抗体表达载体。用这些载体转染CHO细胞并以递增量的氨甲喋呤(MTX)筛选,用ELISA法测定每个加压水平的各组细胞中抗体的表达水平。结果:通过对表达载体中DHFR基因表达调控序列的突变,使DHFR的基础表达水平产生了不同程度的弱化。转染CHO细胞后,可明显提高MTX加压增加抗体表达的效果,抗体表达水平的增加基本与DHFR基因的弱化程度呈正相关。从弱化程度最高的pWS2-BDI组中,我们筛选得到表达量达55μg/(106细胞·24 h)的高表达细胞株,经锌离子进一步诱导后,表达量可达100μg/(106细胞·24 h)以上。结论:弱化表达载体中DHFR的表达,可提高MTX对工程抗体表达的增加效果。

人Delta-like-1胞外区在CHO细胞的表达纯化及对造血祖细胞的扩增作用

Notch信号通路在调控造血干细胞的增殖分化中具有重要作用。本研究克隆表达人Notch配体Delta like 1(Dll 1)的胞外区 (hDll 1ext) ,并观察其对脐带血造血祖细胞的扩增作用。从人骨髓单个核细胞中提取总RNA ,用RT PCR的方法扩增Delta like 1基因胞外区 ,克隆到T载体。测序正确后 ,亚克隆到pcDNA3.1/Myc His(+)A表达载体。用脂质体转染CHO细胞 ,G4 18筛选单克隆 ,Western印迹检测hDll 1ext的分泌表达情况。选择表达量高的细胞克隆 ,扩增并收集上清。用金属亲和层析柱从上清中纯化融合蛋白hDll 1ext。利用免疫磁性分离方法分离脐带血CD34+ 细胞。结果表明 ,RT PCR方法检测到脐带血CD34+ 细胞表达Notch 1受体。在含rhIL 3,rhSCF及rhVEGF的脐带血CD34+ 细胞无血清培养体系中 ,加入纯化的hDll 1ext,通过集落培养检测hDll 1ext对造血祖细胞的扩增作用。含hDll 1ext组中CFU Mix和HPP CFC数量是对照组的 1.5倍 ,结论 :重组的hDll

rCHO细胞在葡萄糖限制流加培养过程中的生长与代谢特性

以调控rCHO细胞的葡萄糖代谢为主要研究目标,通过在2L生物反应器中进行的批培养和葡萄糖限制恒速流加培养的方法,考察了在培养过程中葡萄糖浓度对rCHO细胞生长、葡萄糖和谷氨酰胺消耗,以及副产物乳酸、氨和丙氨酸生成的影响。结果表明:葡萄糖限制的流加培养过程中,活细胞密度XV达到2.35×106cells·mL-1,较批培养提高一倍;而乳酸生成大幅减少。在葡萄糖限制培养阶段,qLac和YLac/Gluc持续降低至零,而qo2/qGluc由0.7mmol·mmol-1上升至4.3mmol·mmol-1,说明更多葡萄糖进入高效释能代谢途径。同时谷氨酰胺的消耗增加,YAmm/Gln增大,YAla/Gln下降,证明谷氨酰胺的能量利用率也有所提高。

携带共扩增基因的CHO细胞表达载体的构建

目的构建携带共扩增基因的CHO细胞表达载体。方法以质粒载体 pCI neo为骨架 ,应用小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的cDNA ,构建了哺乳动物细胞表达载体pCdhfr1。把绿色荧光蛋白基因亚克隆到pCdhfrl的多克隆位点 ,构建了表达质粒 pFP。结果经脂质体法转染CHO细胞 ,以氨甲喋呤为选择标记 ,经过一轮扩增后 ,获得表达绿色荧光蛋白的CHO细胞株。结论应用CHO/DHFR表达系统 ,为构建CHO细胞的工程细胞株建立了良好的模型。