线粒体关联性内质网膜与细胞Ca2+依赖性死亡的研究进展

线粒体关联性内质网膜(MAM)是线粒体和内质网发生交互作用的功能平台。研究发现有几十种蛋白质富集于两细胞器外膜之间,作为MAM蛋白质组成构成连接结构,功能上与Ca^(2+)信号传导等密切相关,影响生理或外源环境因素诱导的细胞转归和命运结局。文章重点阐述了MAM组成结构和功能调节及其在细胞Ca^(2+)依赖性死亡中的作用。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A与肾细胞癌患者临床及预后指标相关性研究

目的探讨细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A)与肾细胞癌(RCC)各参数的相关性。方法在TCGA数据库中筛选出差异表达基因CDKN2A,并在TCGA数据库中验证CDKN2A的表达以及与RCC患者预后情况的相关性。采用Cox回归法进行多因素分析,然后在此基础上构建列线图,进行内部验证。在TIMER数据库中分析CDKN2A与免疫细胞之间的相关性。采用GSEA富集分析,探讨可能的作用机制。结果数据库筛选得到差异表达分子为CDKN2A,CDKN2A在癌组织中的表达高于癌旁组织。TCGA和KM-plotter数据库显示,CDKN2A低表达的RCC患者有更好的预后。列线图C-指数为0.749(0.721~0.776),预测模型具有较好的准确性。TIMER数据库显示CDKN2A的表达与免疫浸润显著相关。结论CDKN2A的表达降低可以显著延长RCC患者的总体生存期、疾病特异性生存期和无进展间隔期,可以用作RCC的新型预测性生物标志物,同时,可能与RCC的免疫浸润相关,在RCC微环境中对于肿瘤细胞发生免疫逃逸可能起重要的促进作用。干扰CDKN2A可能通过参与TP53调节RCC的周期阻滞,从而改善RCC的预后。这些发现为RCC抗癌策略的开发提出潜在的靶点。

全脑缺血再灌注损伤大鼠海马细胞周期依赖性蛋白激酶-5的变化

目的探讨急性全脑缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I-R)损伤时大鼠海马细胞周期依赖性蛋白激酶-5(Cdk-5)的变化。方法用三血管结扎法建立急性全脑I-R大鼠模型。将大鼠随机分为假手术对照组、脑缺血组I、-R组及尼莫地平(nimodipine,NIM)处理组。用免疫沉淀法测定Cdk-5酶活性,用Fura-2负载及荧光测定细胞内游离Ca2+浓度{[Ca2+]i}。结果与假手术对照组比较,脑缺血组及除I-R 5 h亚组外的其余I-R亚组大鼠海马神经元[Ca2+]i升高(P<0.05)且伴细胞内Cdk-5活性升高(P<0.05)。NIM处理组大鼠海马细胞[Ca2+]i低于缺血组及I-R 30 min组(P<0.05,P<0.05),而Cdk-5的活性也低于I-R 30 min组(P<0.05)。结论急性全脑缺血和/或再灌注时大鼠海马神经元Cdk-5活性升高,神经元[Ca2+]i升高对Cdk-5活性升高可能起重要作用。

次乌头碱对心肌细胞内Ca2＋及L-Ca通道mRNA表达的影响

目的：观察次乌头碱对SD乳鼠心肌细胞内Ca2＋浓度及细胞膜L-Ca通道mRNA的影响。方法：原代培养SD乳鼠心肌细胞，给予不同浓度的次乌头碱，采用流式细胞技术分别检测给药后15min、30min、60min心肌细胞内钙浓度的变化，并分析次乌头碱对心肌细胞内钙浓度的作用与L-Ca通道mRNA表达的相互关系。结果：30-120μM／L次乌头碱引起心肌细胞内游离Ca2＋浓度升高，细胞“钙超载”出现在给药后15min（P〈0．01），且呈一定的剂量依赖性，但无明显的时间依赖性；60μM／L次乌头碱与心肌细胞作用5min即能增加L—Ca通道mRNA表达（P〈0．05），随着次乌头碱浓度的增加，L—Ca通道mRNA的表达也增多，但亦未表现出明显的时间依赖性。结论：次乌头碱为附子中的主要成分之一，其可能通过增加心肌细胞膜L-Ca通道开放数量而导致细胞内钙增加，发生钙超载，并最终导致心律失常的发生。

利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除苹果酸脱氢酶2(malate dehydrogenase 2,MDH2)基因的IPEC-J2单克隆细胞株,并研究敲除MDH2基因后抗呕吐毒素效应。针对MDH2基因序列设计sgRNA插入PX459载体中,构建PX459-sgRNA-MDH2重组质粒;将质粒通过电转导入IPEC-J2细胞中,并加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型测序鉴定、荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证,获得MDH2基因敲除的单克隆细胞株;最后通过CCK8试剂盒和细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测细胞存活情况,测定MDH2敲除细胞株对呕吐毒素的抗性。测序结果显示MDH2基因敲除载体构建成功。利用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法验证了获得的细胞系为MDH2基因敲除的单克隆细胞株。CCK8细胞活力实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2可使IPEC-J2细胞在不同浓度呕吐毒素(4、2、1和0.5μg/mL)处理5 d时细胞活力分别极显著提高18.67%、19.59%、26.36%和27.01%。流式细胞仪实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2使不同浓度呕吐毒素处理5 d的细胞死亡率分别极显著降低30.33%、15.81%、16.00%和14.70%。利用CRISPR/Cas9系统对IPEC-J2细胞中的MDH2基因进行敲除并筛选获得了MDH2-KO单克隆细胞株,并通过细胞活力和细胞死亡检测,证明该细胞株具有抗呕吐毒素毒性效应的效果,为揭示呕吐毒素诱导宿主细胞死亡的毒性机制提供借鉴,为防治呕吐毒素提供新策略。

CaMKⅡ/ERK信号通路在TGFβ1诱导肝星状细胞增殖中的作用

目的观察Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)信号通路对TGFβ1诱导下人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖的影响。方法 CaMKⅡαsiRNA转染对HSC内CaMKⅡα进行干扰,ERK特异性抑制剂PD98059对ERK信号进行抑制,MST法检测HSC的增殖,Western blotting法检测ERK、p-ERK、JNK、p-JNK表达的变化。结果 CaMKⅡαsiRNA可显著抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,差异有统计学意义(P<0.05),对ERK的表达无明显影响,但显著提高p-ERK的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05);PD98059可明显抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CaMKⅡ/ERK信号参与了TGFβ1诱导的HSC增殖,是肝纤维化发展过程中的重要信号通路。

植物细胞程序性死亡调控机制的研究进展

植物细胞程序性死亡(PCD)受活性氧、Ca2+、激素、基因等多方面影响。充分理解PCD的生物学意义和精确调控PCD进程的速度,有助于改变植物尤其是作物生长发育进程中某一阶段的发育速度,对于作物促壮抗衰有着非常积极的意义。

替码板栗芽体PCD过程中Ca^(2+)的时空变化

【目的】探讨Ca^(2+)在替码板栗品种X12芽体细胞程序性死亡(PCD)过程中的时空变化及其与芽体PCD的关系。【方法】利用焦锑酸盐沉淀的电镜细胞化学方法,研究替码板栗X12芽体PCD过程中(S1～S5时期) Ca^(2+)的时空变化。【结果】S1时期,细胞结构正常,Ca^(2+)主要分布在细胞壁和细胞间隙处,细胞质和细胞核内有少量Ca^(2+),液泡内Ca^(2+)含量极少;S2时期,部分细胞器轻微降解,细胞间隙中Ca^(2+)减少,细胞质、液泡膜和细胞核膜附近Ca^(2+)开始增多;S3时期,细胞进一步解体,细胞壁、液泡、细胞核降解严重,细胞间隙和细胞壁上Ca^(2+)颗粒极少,细胞质、细胞核、破裂的液泡内及液泡周围Ca^(2+)明显增多;S4时期,细胞降解严重,Ca^(2+)在细胞内呈无规则分布,质膜和细胞壁上较少,集中于破碎的液泡膜和液泡碎片处;S5时期,细胞器均降解破碎,Ca^(2+)随降解的细胞器碎片成块状聚集。【结论】替码板栗芽体PCD过程中Ca^(2+)呈动态变化,Ca^(2+)可能参与了PCD过程;细胞质、液泡和细胞核的Ca^(2+)内流可能是引起替码板栗芽体PCD的部分重要原因。

淫羊藿苷激活抑制鼻咽癌CNE-2细胞存活、侵袭、迁移的体内外研究

【目的】探讨淫羊藿苷对鼻咽癌CNE-2细胞存活和侵袭迁移特性的影响。【方法】(1)体外研究:用不同浓度淫羊藿苷处理鼻咽癌CNE-2细胞,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)测定细胞增殖能力以选择合适的剂量进行后续实验。采用Transwell实验观察细胞侵袭能力;划痕实验观察细胞迁移能力;蛋白免疫印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)、上皮钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达情况及信号通路蛋白Ca2+/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化情况。并进一步观察单独或联合JNK抑制剂SP600125对JNK活化程度的影响,采用蛋白免疫印迹法检测细胞JNK磷酸化水平。(2)体内研究:建立鼻咽癌CNE-2荷瘤裸鼠模型,测定裸鼠移植瘤质量、细胞凋亡和移植瘤组织VEGF表达情况、MVD值。【结果】选择低细胞毒性10、20、50μmol/L剂量的淫羊藿苷进行后续实验。与空白对照组(淫羊藿苷0μmol/L)比较,淫羊藿苷10、20、50μmol/L组CNE-2细胞侵袭细胞数、划痕愈合率降低,细胞VEGF、N-cadherin、Vimentin表达水平明显降低(P <0.05),E-cadherin表达水平与CaMKⅡ、JNK的磷酸化水平升高(P <0.05),均呈剂量依赖性。淫羊藿苷(10μmol/L)可减弱JNK抑制剂SP600125对JNK磷酸化的抑制作用。与模型组比较,淫羊藿苷组鼻咽癌裸鼠存活率升高,移植瘤质量减小,移植瘤组织细胞凋亡率升高,VEGF表达水平、MVD值明显下降(P <0.05)。【结论】淫羊藿苷可促进CaMKⅡ/JNK通路激活来抑制鼻咽癌CNE-2细胞的存活、侵袭和迁移能力。

神经肽Y对大鼠心肌细胞Ca2＋-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响

目的 探讨神经肽Y对大鼠心肌细胞ca2＋-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ）的影响.方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,分为对照组（n=6）和神经肽Y组（n=6）,神经肽Y组加入终浓度为100 nmol/L的神经肽Y,对照组不进行处理.处理15 min后采用同位素32P掺人法检测心肌细胞CaMK Ⅱ活性,免疫印迹法（Western blotting）检测磷酸化CaMK Ⅱ（p-CaMK Ⅱ）蛋白表达;处理24 h后激光共聚焦显微镜下记录心肌细胞静息状态下细胞核Ca2＋-浓度,实时定量PCR检测心肌细胞β-肌球蛋白重链（β-MHC）、心钠素mRNA表达.结果 神经肽Y刺激心肌细胞15 min后,神经肽Y组CaMK Ⅱ活性较对照组明显升高（336 094.80±10 744.61比273 301.50±16 737.99,P＜0.05）,P-CaMK Ⅱ蛋白表达明显增加.神经肽Y刺激心肌细胞24 h后,神经肽Y组心肌细胞胞核Ca2＋-浓度较对照组明显增加（226.87±17.37比84.04±6.50,P＜0.01）;实时定量PCR显示β-MHC、心钠素mRNA表达亦明显增加.结论 神经肽Y通过增加心肌细胞胞核Ca2＋浓度活化CaMK Ⅱ.CaMK Ⅱ可能在神经肽Y诱导心肌细胞肥大效应中起着重要作用.

抑制剂KN-93干预二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常的蛋白质组学分析

目的使用蛋白质组学分析抑制剂KN-93干预二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常的作用。方法60只SPF级SD大鼠乳鼠,雌雄不限,提取心肌组织,体外培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,分为对照组和实验组,对照组使用100μmol/L二乙酰吗啡作用24 h,实验组使用100μmol/L二乙酰吗啡+1μmol/L KN-93作用24 h。采用TMT相对定量蛋白质技术筛选出对照组和实验组之间具有显著性表达差异蛋白质,筛选标准:表达倍数上调>1.2倍或下调<0.83倍且P<0.05。通过GO功能富集分析差异表达蛋白质的主要功能、细胞定位和参与的生物学过程,通过KEGG通路富集分析差异表达蛋白质可能参与的代谢或信号通路,通过蛋白质相互作用网络分析蛋白质之间有结合作用或相互作用。结果与对照组比较,实验组Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)磷酸化水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);TMT技术共筛选出346个差异表达蛋白质,主要参与对细胞因子的反应、细胞对细胞因子刺激的反应等过程,影响相同的蛋白质结合、信号受体结合等分子功能和细胞外区域部分、胞外区等细胞组分蛋白,主要富集在癌症途径、PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、阿尔茨海默病等信号通路。蛋白互作网络显示,MSH6、NFk B1等可能与CaMKⅡ存在蛋白质互相作用关系。与对照组比较,实验组ADCY7、NFk B1、MSH6、MMP2、MMP9、NQO1、TXNRD1蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CaMKⅡ可能通过调控NFk B、MSH6等蛋白的改变,通过癌症途径信号通路调节心肌细胞凋亡,参与二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常过程。

活性氧和钙离子参与镉诱导的酵母细胞死亡过程调节

以酵母为实验材料,研究了镉（以CdCl2形式添加）对细胞的毒性作用机制.结果显示,浓度为0.25~5 mmol·L-1的镉可降低酵母细胞活性,诱导细胞死亡;随着镉浓度的提高和处理时间的延长,细胞死亡率增高.凋亡抑制剂Z-Asp-CH2-DCB与镉共同作用后,细胞死亡率明显低于镉单独处理组.经镉处理后,酵母细胞内的活性氧（ROS）水平显著升高;外源抗氧化剂抗坏血酸和过氧化氢酶能降低镉引发的细胞死亡,特异性Ca2＋螯合剂EGTA或Ca2＋通道特异性抑制剂LaCl3亦可明显降低镉诱发的细胞死亡率.研究表明,镉诱发的酵母细胞死亡过程存在依赖于caspase途径的细胞凋亡途径;镉诱发的死亡与镉处理组胞内ROS和Ca2＋水平升高有关,ROS可能通过增加胞内Ca2＋水平,继而激活相关下游信号导致细胞死亡.

荷包牡丹碱对海马CA2区的神经毒性与P/Q型钙通道有关

目的:探讨荷包牡丹碱(BiC)对海马CA2区的神经毒性作用以及电压依赖性钙通道(VDCC)对神经毒性作用的影响。方法:BiC 6μmol·L^(-1)刺激培养的大鼠海马组织72 h,同时用N,L以及P/Q型钙通道拮抗剂分别阻断相应的钙通道,测定神经细胞摄取的碘化丙啶(PI)。结果:BiC刺激6 h后,神经细胞的PI摄取首先出现在CA2区。随着BiC刺激时间的延长,摄取PI的神经细胞的分布范围由CA2区扩散到其他区域。P/Q型VDCC拮抗剂抑制神经细胞的PI摄取,然而N和L型VDCC的拮抗剂无明显抑制效果。结论:在大鼠海马的组织培养中CA2区的神经细胞对BiC的刺激最易受损。CA2区神经细胞的损伤过程中P/Q型VDCC起重要作用。

二氧化硫诱导蚕豆气孔保卫细胞死亡效应研究

采用蚕豆叶面气孔保卫细胞,研究SO2衍生物(Na2SO3与NaHSO3混合液,3:1,mmol·L-1)对细胞的致死效应.结果表明,在浓度1～4mmol·L-1内,SO2衍生物暴露3h可使表皮保卫细胞活性降低,部分细胞死亡,并致胞内活性氧和Ca2+水平升高;随着处理浓度的提高细胞死亡率增高.一定浓度的抗坏血酸(AsA)或过氧化氢酶(CAT)与SO2衍生物共同作用时,胞内活性氧水平降低,细胞死亡率下降.Ca2+螯合剂乙二醇双四乙酸(EGTA)或Ca2+通道抑制剂LaCl3与SO2衍生物共同作用时,胞内钙水平与细胞死亡率降低.LaCl3能降低H2O2诱导的细胞死亡率.研究结果表明,SO2致蚕豆保卫细胞死亡与胞内活性氧水平增高有关,活性氧能激活质膜Ca2+通道,使胞外Ca2+内流,造成胞内Ca2+浓度升高,介导细胞死亡;胁迫组气孔保卫细胞活性降低或死亡,将导致气孔运动失调.

脑缺血损伤与再生修复的分子调控

一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）在脑损伤中起重要作用，我们先前研究发现，半暗区诱生型NOS（in—dueible NOS，iNOS）表达介导了脑缺血损伤。前脑缺血导致选择性的海马CA1区锥体细胞死亡，而海马其他区域的神经元保持完好。我们发现前脑缺血诱导NMDA受体2A亚型（NR2A）的Ser1232磷酸化，此磷酸化受细胞周期素依赖激酶5（Cdk5）调节，抑制内源性Cdk5或阻断Cdk5与NR2A的相互作用可抑制NR2A磷酸化，保护脑缺血损伤。继而我们研究脑缺血后Cdk5活性的调控，在海马CA1区表达Ca^2＋不通透的突变型AMPA受体GluR2R或激活CRE转录可阻止神经元死亡，相反表达Ca^2＋通透的突变型AMPA受体GluR2Q则诱导神经元死亡。

溶酶体膜通透化在铀诱导肾近端小管上皮细胞死亡中的作用及机制

目的探究铀(Uranium,U)暴露诱导人肾近端小管上皮HK-2细胞溶酶体膜通透化(LMP)致细胞死亡的作用及机制。方法以100、300、600μmol/L铀染毒HK-2细胞24 h,分别采用DCFH-DA荧光探针法和MitoSOX荧光探针法检测不同浓度铀染毒的HK-2细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和线粒体超氧化物的生成。将HK-2细胞分为:空白对照组、单纯N-乙酰半胱氨酸(NAC)或CA-074 Me组、单纯铀染毒组和铀联合NAC或CA-074 Me组,采用双色免疫荧光法检测HK-2细胞内半乳凝素-1(Galectin-1)与溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)共定位情况以检测溶酶体膜通透化(lysosomal membrane permeability,LMP)程度,或检测Cathepsin B与LAMP-1非共定位情况以反映溶酶体内Cathepsin B的释放情况,钙黄绿素(Calcein-AM)-碘化丙啶(PI)双染色法检测HK-2细胞死亡情况,单色免疫荧光法检测HK-2细胞内Cleaved-caspase-3表达以检测细胞凋亡情况。结果100、300、600μmol/L铀染毒HK-2细胞24 h诱导细胞内ROS或线粒体超氧化物生成与0μmol/L铀对照组比较明显增加,分别为1.1~2.5倍或4.0~28倍(t_(ROS)=17.98、11.84、11.75,P<0.05;t线粒体超氧化物=6.14、16.02、13.06,P<0.05),且随铀浓度增加而显著增加(t_(ROS)=10.10、10.37、5.59,P<0.05;t线粒体超氧化物=21.50、15.16、5.93,P<0.05)。与空白对照组相比,600μmol/L铀染毒24 h使HK-2细胞中Galectin-1和LAMP-1共定位率及Cathepsin B和LAMP-1非共定位率显著增加,分别为5.4~6.7倍或1.5~2.1倍(t_(Galectin-1)=15.85、12.70,P<0.05;t_(Cathepsin) B=5.95、6.69,P<0.05),而给予NAC处理则能抑制其增加(t_(Galectin-1)=4.74,P<0.05;t_(Cathepsin) B=4.51,P<0.05);而且,600μmol/L铀染毒24 h使HK-2细胞死亡率及Cleaved-caspase-3表达水平较空白对照组显著增加,分别为28~47倍或2.4~6.0倍(tPI=30.40、10.34,P<0.05;t_(Cleaved-caspase-3)=18.49、9.52,P<0.05),而给予CA-074 Me处理则能显著降低铀暴露HK-2细胞的死亡率及Cleaved-caspase-3表达水平(tPI=6.76,P<0.05;t_(Cleaved-caspase-3)=13.47,P<0.05)。结论铀暴露诱导HK-2细胞内ROS爆发导致LMP,致使溶酶体内Cathepsin B泄露至胞质中进而触发溶酶体依赖性细胞死亡和线粒体途径的细胞凋亡。

心脏T型钙离子通道

心肌细胞膜存在两种不同的Ca2＋通道（L型和T型）。1953年Fatt和Katz首次发现电压依赖性Ca2＋内流这种重要生理特征,1975年Hagiwara等人经研究又进一步证实。心脏电压依赖性Ca2＋通道被认为与细胞膜去极化过程中调控Ca2＋内流和参与细胞的兴奋、收缩、激素分泌及相关基因转录相关。20世纪80年代,在心肌细胞中第一次记录到两种不同的Ca^2＋通道：L型和T型Ca^2＋通道。

血管性痴呆病因病机与发病机制研究概况

血管性痴呆(vascular dementia,VD)属中医学"呆病"、"痴证"等范畴,为肾精亏虚-髓海不足、痰、浊(水湿)-瘀血等蒙蔽(阻)脑窍、玄府郁阻、浊毒内侵、本虚标实、气血亏虚、三焦气化失司、伏邪内生-损害元神、脏腑功能失调、络脉学说;病理机制包括中枢胆碱能、兴奋性氨基酸、氧自由基、神经细胞凋亡、细胞和分子(海马Ca2+、钙调素CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ-CaMPKⅡ,内皮素-1-ET-1降钙素)、炎性反应、遗传机制、危险等。中医虽然对血管性痴呆发病原因论述较多,但机理尚未明确,未能达成共识,亦有待于临床与实验进一步检验,对呆病诊断也需扩展其内涵。认为现代医学虽在科研上取得一些研究成果,但也存在一定问题,未来应统一实验标准、设计严谨科研方案等,指导临床VD治疗,判断治法方药优劣性及稳定性。