大肠埃希菌生物被膜表型、基因型与多重耐药的相关性分析

【目的】探讨大肠埃希菌生物被膜表型、基因型与大肠埃希菌多重耐药的相关性。【方法】收集临床分离的230株大肠埃希菌,采用多重PCR法进行基因分型,采用改良结晶紫方法测定生物被膜形成能力,采用K-B法进行药敏试验。统计并分析大肠埃希菌耐药情况,大肠埃希菌生物被膜表型与多重耐药情况,大肠埃希菌基因型与多重耐药情况,大肠埃希菌生物被膜基因型与多重耐药的关系。【结果】大肠埃希菌对氨苄西林、头孢呋辛、环丙沙星耐药率均较高,对哌拉西林耐药率较低,对亚胺培南无耐药性;大肠埃希菌生物被膜表型分为强、中等、弱、无,分别占3.91%、31.30%、57.83%、6.96%,其中中等和弱占比较高,生物被膜形成能力越强,其多重耐药率越高;大肠埃希菌基因型中CTX-M-9基因型菌株数占比最高,为35.65%;Spearman相关性分析显示,大肠埃希菌生物被膜形成能力与多重耐药率呈正相关(P=0.012)。【结论】大肠埃希菌生物被膜形成能力与多重耐药率有关,各基因型对多种抗生素均表现为耐药,临床应合理应用抗生素。

铜绿假单胞菌普通菌毛与耐药性R质粒的关系

目的 :检测铜绿假单胞菌耐药株 PA36的耐药性 R质粒与菌毛及粘附性的关系。方法 :应用琼脂糖凝胶电泳试验、电镜照片制备及观察、粘附试验及质粒消除试验。结果 :PA36含有一条相对分子质量是 3.3× 1 0 6 的R质粒 ;电镜下观察 PA36具有周毛型菌毛 ;粘附试验于光镜下可见该菌大量粘附到脱落的尿道上皮细胞上 ;该 R质粒消除后该菌株的耐药性与菌毛一起消失 ,粘附性明显减弱。结论 :铜绿假单胞菌菌株 PA36编码普通菌毛、决定粘附性的基因主要是在相对分子质量为 3.3× 1 0 6 的一个

不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制和治疗进展

不动杆菌已成为医院感染的主要致病菌。随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用,其多重耐药菌尤其是碳青霉烯类耐药菌株的出现,给临床治疗带来了很大的难题。研究发现,不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要是灭活酶的产生,其中以染色体或质粒介导的各种碳青霉烯酶最为重要。而舒巴坦和β-内酰胺类药物合用对不动杆菌有一定的治疗协同作用。

双J管生物被膜菌临床特性及其相关基因研究

[目的]研究双J管生物被膜菌的临床分布,对抗生素的耐药特性及粪肠球菌相关基因与生物被膜形成的关系.[方法]收集本院92例患者双J管.筛选生物被膜菌株和相应浮游菌株;浮游菌与双J管生物被膜菌在MH培养基上作耐药性分析;生物被膜阳性菌在泊洛沙姆培养基和普通MH培养基上作耐药差异性分析.实时荧光定量PCR方法对生物被膜菌组和浮游菌组细菌中ebpA、gelE两种与生物被膜形成相关的基因表达进行检测.[结果]92例患者双J管中筛选出生物被膜菌41株,阳性率为45%;生物被膜菌与相应的浮游菌比较,在普通MH培养基上药敏结果相似,无统计学差异（P＞0.05）;生物被膜菌在Poloxamer培养基和MH培养基上药敏结果差异有统计学意义（P＜0.05）,且前者耐药性更强.生物被膜菌组ebpA,gelE表达量分别是浮游菌组的2019倍和1/138.[结论]本院双J管生物被膜菌在临床上以肠球菌属和葡萄球菌属为主;生物被膜菌与浮游菌耐药性无见明显差异, Poloxamer培养基可模拟出生物被膜菌的生存环境,而且对药物的耐受性更强.ebpA与促进生物被膜形成有关,gelE与抑制生物被膜形成有关.

耐药鲍曼不动杆菌扩增片段长度多态性分析指纹图谱数据库的建立

目的:建立鲍曼不动杆菌扩增片段长度多态性分析(AFLP)指纹图谱数据库。方法:采用NCCLS 2004年版抗生素敏感性判断方法研究药物敏感性,采用AFLP技术研究鲍曼不动杆菌基因型,以AFLP结果建指纹图谱立数据库。结果:药敏结果和AFLP指纹图谱数据库进行的聚合分析结果具有一致性。结论:AFLP指纹图谱数据库具有实用价值。

耶氏肺孢子菌对磺胺类药物耐药相关基因突变的研究进展

肺孢子菌肺炎是由耶氏肺孢子菌引起的,发生在免疫功能低下人群中的机会性感染。大量证据表明,耶氏肺孢子菌对磺胺类药物耐药性增加与二氢叶酸合成酶(DHPS)基因和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因突变有关,但具体机制尚不清楚。DHPS和DHFR基因突变增加可能是药物选择性压力所致,也可能是耶氏肺孢子菌基因多态性自然发展和传播的结果。本文对耶氏肺孢子菌DHPS和DHFR基因突变产生的原因、分子流行病学研究进展及其与临床结局的关系进行了综述。

T7 RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定

目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1(+)。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1(+)/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。

噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库的构建

目的构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及结构和功能的研究打下基础。方法应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域。用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z结构域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体库。并在突变体片段两端引入KpnⅠ位点,3′端引入3个氨基酸大小随机连接肽的序列。经KpnⅠ酶切后随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S。克隆产物转化大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示定点随机突变组合文库。结果该定点随机突变组合文库的转化子数目为6.4×106个,滴度为1.4×1015TU/L;文库中含0.72以上的阳性克隆,其中有2个单结构域的阳性克隆占0.15;15个样品的序列分析显示各突变位点和随机连接肽的氨基酸序列呈随机性分布。结论成功构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,该库库容量在一级结构上具有良好的随机性和多样性,可满足体外分子进化研究的要求。

人源性抗乳腺癌HER2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库，筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv，为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织，提取总RNA；构建可变区基因的T载体库，将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接，获得pCANTAB-scFv，电转化感受态大肠杆菌TG1；以M13K07辅助噬菌体进行感染，获噬菌体抗体库；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性，以免疫组织化学法检测抗体亲和力，并通过测序进一步鉴定。结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库，获得的scFv长度为750bp，VH和VL长度分别为375和330kb；电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确，得到库容为2．48×10^8的大容量抗体库；通过噬菌体展示和淘洗筛选，富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库；所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性，对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力；测序结果与人IgG抗体进行对比，所获得的scFv具有高度的人源性。结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库，并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv，为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。

艾滋病合并分枝杆菌感染患者分枝杆菌菌种鉴定

目的：对艾滋病合并分枝杆菌感染患者菌株标本进行菌种鉴定，评价MPB64抗原胶体金法快速检测试剂盒鉴别分枝杆菌的价值。方法：对艾滋病患者临床标本中培养出的140株分枝杆菌菌株用16SrDNA测序的方法进行菌种鉴定，分析艾滋病患者中常见非结核性分枝杆菌（NTM）菌种，同时对这些标本用MPB64抗原免疫胶体金法进行菌株鉴定，分析后者的敏感性和特异性。结果：以16SrDNA测序结果为金标准，MPB64抗原胶体金法快速检测区分结核分枝杆菌（MTB）与NTM的敏感性和特异性分别为96．00％和96．84％。共有114份标本（114／140，81．43％）获得明确鉴定结果，其中50份（43．86％）为MTB，63份标本（55．26％）鉴定为NTM。最常见的NTM菌种为戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。结论：MPB64抗原胶体金法检测分枝杆菌菌种具有较好的特异性，且快速、经济、简便，适合用于临床对MTB及NTM的初步鉴别。艾滋病合并结核患者中NTM的比例较高，需进行菌种鉴定以指导临床治疗。

噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库的构建

目的构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,研究IgA结合分子结构与功能的关系。方法基因合成IgA亲和体ZA1、ZA2片段。片段两端引入Kpn I酶切位点,3′端引入随机连接肽序列,Kpn I酶切,随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S的Kpn I克隆位点上,转化大肠杆菌TGI,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示随机组合文库。结果基因合成IgA亲和体;构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,容量为3·4×107,滴度为1·6×1012TU/L;文库中含79%以上的阳性克隆;序列分析显示组合文库由ZA1、ZA2随机组合而成,连接方式符合随机连接的特点,各亲和体之间连接肽序列也呈随机分布。结论合成IgA亲和体,构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,该文库库容量、多样性和随机性可满足体外分子进化研究的要求。

幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA+Hp)感染与所致疾病种类的关系。方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp。采用PCR检测109株HpcagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2148bp的cagA基因片段(cagA1)。构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Westernblot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性。建立ELISA,检测109株HpCagA表达和相应患者血清中CagA抗体。分析CagA+Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系。结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性。与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%。所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%。rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体。92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1%患者(96/109)血清CagA抗体阳性。消化性溃疡标本中CagA+Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05)。

用兔IgG筛选噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库

目的应用噬菌体展示免疫球蛋白(Ig)结合分子组合文库,进化筛选获得与兔IgG结合的代表性序列,测定其与兔IgG及人IgG结合活性的差异,以判断筛选获得的代表性序列对不同种属Ig的结合是否存在倾向性的差别。方法应用包含Ig效应子结合蛋白Protein A的D结构域(PA-D)、A结构域(PA-A),Protein G的B2结构域(PG-B2)及protein L的B3结构域(PL-B3)的单结构域随机组合文库,以兔IgG对该组合文库进行进化筛选,序列比较分析筛选获得的代表性序列与人IgG进化筛选文库所得代表性序列的异同性;用ELISA和竞争抑制试验分别测定阳性噬菌体克隆与兔IgG及人IgG的结合活性。结果以兔IgG经4轮分子进化筛选,获得在天然细菌蛋白中不存在的新的结构形式PA-A—PA-A,该结果与人IgG进化筛选所得代表性序列PA-A—PG有显著差异;兔IgG筛选序列PA-A—PA-A和人IgG筛选序列PA-A—PG分别显示出与兔Ig和人Ig结合力更强的特性。结论该研究首次应用噬菌体展示技术研究不同种属抗体效应子构象的不同,证实兔IgG和人IgG两者效应子构象之间确实存在差异。这一结论有助于阐明抗体效应子构象在不同种属之间的差异性。

构建SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库

目的构建免疫球蛋白结合分子金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)和链球菌蛋白G(SPG)单结构域随机组合噬菌体展示文库,为研究其分子功能与结构的关系奠定基础。方法 PCR扩增制备SPA的A、B、C、D、E结构域和SPG的B2结构域核苷酸片段,在片段两端通过引物引入XbaⅠ酶切位点和保护碱基,3'端引入3个氨基酸大小的随机连接肽核苷酸序列,各结构域核苷酸片段经XbaⅠ酶消化,在T4连接酶作用下随机相互连接并克隆于噬菌体展示载体pCANT-AB5S,克隆产物转化E.coliDH5α,提取原代库质粒转化E.coliTG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库。结果该噬菌体展示文库库容量为1.87×107cfu,滴度为1.3×1014TU/ml,文库的片段插入率近100%,其中插入多个结构域的阳性克隆占21.7%,序列分析显示各结构域之间的连接和随机连接肽序列具有随机性。结论成功地构建了SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库,该文库在库容量、多样性和随机性方面满足体外分子进化研究的要求。

医院内多重耐药非发酵菌产金属酶的研究

目的研究北京天坛医院多重耐药非发酵菌产金属酶情况。方法收集北京天坛医院多重耐药铜绿假单胞菌44株、鲍曼不动杆菌20株和嗜麦芽窄食单胞菌4株，通过双纸片协同试验对68株非发酵茵进行金属酶的表型筛选，对金属酶基因IMP、VIM进行聚合酶链式反应及序列分析。结果68株非发酵菌中，4株菌扩增出IMP-1型金属酶，并且均分离自铜绿假单胞茵，未检测到VIM型金属酶基因。结论对于北京天坛医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌，产IMP-1型金属酶是一种重要的耐药机制。

大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性及耐药基因检测

目的:了解大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药情况与耐药基因携带情况。方法:使用K-B法检测大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,同时用PCR技术扩增氨基糖苷类抗生素的耐药基因以明确其基因型。结果:40株大肠埃希菌中耐氨基糖苷类抗生素菌株32株,耐药率为80.0%(32/40),其中aac(3)-Ⅰ 2株,占6.3%(2/32),aac(3)-Ⅱ 28株,占87.5%(28/32),aac(6′)-Ⅰ 12株,占37.5%(12/32),aac(6′)-Ⅱ 8株,占25%(8/32),ant(2″)-Ⅰ 4株,占18.8%(6/32),ant(3″)-Ⅰ 9株,占28.1%(9/32)。结论:耐氨基糖苷类抗生素的大肠埃希菌比较普遍,氨基糖苷类耐药基因以aac(3)-Ⅱ和aac(6′)-Ⅰ为主。

大肠埃希菌Ⅰ类整合子与耐药性分析

目的:了解Ⅰ类整合子在临床分离大肠埃希菌和健康人群大肠埃希菌中分布流行状况。方法:根据NCCLS推荐的琼脂稀释法进行药敏试验;PCR扩增Ⅰ类整合酶基因。结果:患者大肠埃希菌Ⅰ类整合子检出率为45.4%;健康人大肠埃希菌Ⅰ类整合子检出率为5.4%。108株患者大肠埃希菌对12种抗菌药物耐药率,最高为氨苄西林97.2%,最低为亚胺培南0.93%。结论:Ⅰ类整合子在患者大肠埃希菌中的存在已经相当普遍,健康人群大肠埃希菌也携带有Ⅰ类整合子,应加强基因水平耐药监测。

利用环介导等温扩增技术快速检测肠出血性大肠杆菌及其毒素的方法建立和评价

目的针对编码大肠杆菌志贺毒素由位于STEC染色体上的前噬菌体携带的stx基因和O_(157)抗原编码基因rfbe设计特异性引物,并对反应体系和反应条件进行优化,建立一种针对肠出血性大肠杆菌及其毒素的环介导等温扩增(LAMP)反应技术检测法。方法通过优化LAMP反应的各影响因素,确定LAMP反应体系和反应条件并利用已优化的LAMP体系进行相关检测。结果确定LAMP反应体系为:内引物(FIP、BIP)与外引物(F3、B3)的比例为8:1,Mg^(2+)浓度10 mmol/L,dNTPs浓度1. 2 mmol/L,甜菜碱浓度0. 4 mol/L,Bst DNA聚合酶的添加量为1μl。LAMP反应时间为60 min,反应温度为60。以PCR法作为对照,LAMP检测的敏感度为5×10~1 CFU/mL,PCR的敏感度为5×10~4 CFU/mL。同时,研究应用所建立的LAMP快速检测法对部分革兰阳性和阴性菌及102株O_(157)大肠杆菌进行快速检测。结果显示,检测特异度达100%,O_(157)大肠杆菌rfbe检出率为100%(102/102),stx1检出率为95. 2%(59/62),stx2检出率为92. 9%(52/56)。结论成功建立了一种可应用于肠出血性大肠杆菌及其毒素的敏感、特异的LAMP检测方法。