细菌人工染色体文库及其应用

细菌人工染色体是１９９２年以来发展起来的一种新型克隆载体，用于构建人、动物、植物核基因组ＤＮＡ大片段插入文库。细菌人工染色体在文库构建中具有转化效率高、构建文库简单、嵌合体少、插入片段容易回收、在寄主细胞中插入片段稳定性好、插入片段较大等优点。细菌人工染色体文库的构建对于基因组较大的真核生物基因组学研究具有重要作用，该文库可用于真核生物重要性状基因及全基因组的物理作图、重要农艺性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析等研究。本文主要综述了细菌人工染色体文库的构建及其在图位克隆基因、荧光原位杂交、全基因组物理作图等研究中的应用进展。

关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究

细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷 ,并结合凝胶回收纯化技术 ,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上 ,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件 ,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间 ,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关键步骤。

云南药用野生稻核基因组细菌人工染色体(BAC)文库的构建与分析

通过云南药用野生稻核基因组BAC文库的构建,保存处于濒危状态的云南药用野生稻遗传资源。该文库包含27500个克隆,随机挑取80个克隆检测,插入片段平均大小为80kb,文库容量相当于水稻基因组大小的5.1倍。

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

为构建全基因组鸡马立克氏病病毒814株感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC),首先通过构建表达Eco-gpt(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase,XGPRT,gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1-3 kb)和带有细菌人工染色体的基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11,将重组病毒转移载体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞,在选择培养基中经过8轮加压筛选,获得并纯化重组病毒;将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌,筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒,提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果表明,MDV-BAC2 DNA再次启动病毒感染,拯救了重组鸡马立克氏病病毒。成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体,为方便利用现代RED/ET基因重组系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台;同时为研究鸡马立克氏病病毒的基因功能和开发新型马立克氏病疫苗奠定了基础。

猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定

为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC^(PRV-G)。提取BAC^(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC^(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA^(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。

棉花细菌人工染色体的荧光原位杂交(BAC-FISH)技术

细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)技术是植物染色体识别、物理作图等分子细胞遗传学研究的重要工具,但对于某些物种尤其是多倍体植物,由于大量重复序列的存在等问题,使得该技术应用受到很大的限制.通过选择棉花分子遗传图中高重组区的微卫星位点(simple sequence repeats,SSR)标记的策略,筛选到不含或含有少量重复序列的细菌人工染色体(BAC)克隆,同时,在通用FISH技术程序基础上,通过改进发根、变性、洗脱条件等步骤,构建出适合于棉花的BAC-FISH技术,简化了操作流程的同时,获得稳定的杂交结果及较高的检出率;并通过将一随机获得的BAC进行染色体的物理定位,进一步引入双探针、双色及重复杂交技术,显示了该技术的成熟与良好的应用前景和价值.

细菌人工染色体(BAC)及其分析和修饰方法简介

细菌人工染色体是一种新发展起来的DNA载体系统 ,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点 .在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用 .综述了近年来发展起来的对BAC进行分析和修饰的一些方法 .

用同源重组法修饰含人α类珠蛋白基因簇的细菌人工染色体

采用RecA蛋白介导的同源重组的方法 ,对本实验室筛选出的包含完整人α 类珠蛋白基因簇的细菌人工染色体 (BAC)DNA进行删除修饰。首先采用PCR的方法 ,分别在预删除的HS - 40增强子区域的上游和下游克隆长度约为 5 0 0bp的两段同源序列 ,并一起克隆到构建载体 pBV的XbaI和HindIII位点上 ,SalI酶切后回收 1kb左右的片段并克隆到温度敏感的穿梭质粒 pSV -RecA中 ,转化带有人α 类珠蛋白基因簇的BACDNA的感受态大肠杆菌DH10B ,经氯霉素正筛选和镰孢菌酸的负筛选 ,获得发生两次同源重组后只含BACDNA而穿梭载体已丢失的菌株 ,经Southern杂交鉴定 ,获得了HS - 40被定位删除的BAC突变体克隆。

火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建

火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。【目的】本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)。【方法】利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和BAC载体pBeloBAC11的基本功能序列,构建重组病毒转移载体pGAB-gpt-BAC11。通过将pGAB-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病毒噬斑后,利用霉酚酸(MPA)阻断核酸代谢途径,经过筛选获得纯化的重组病毒purified-rHVT。提取purified-rHVT感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆,并用酶切和PCR方法对其进行鉴定。随机选取BAC克隆提取BACDNA转染次代CEF,完成HVT重组病毒的拯救。【结果】经过6轮筛选后获得纯化的重组病毒,并筛选到25个BAC分子克隆化病毒。其中BAC6、BAC8和BAC10再次启动病毒感染,产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态,说明已经获得拯救出的HVT重组病毒。【结论】本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体,建立了HVT反向遗传操作技术平台。

高产优质抗病棉花品种中棉所12号细菌人工染色体(BAC)文库构建

中棉所12号是我国自育的高产、优质、抗枯萎病、耐黄萎病棉花品种,其重要创新是使抗性和产量、品质得到结合改良和提高。本研究以plndigoBAC-5为载体,对中棉所12号进行了细菌人工染色体(BAC)文库构建。初步建立的文库含有38800个克隆,覆盖2倍基因组。对文库中132个重组克隆的分析表明:插入片段为50～150kb,平均大小为120kb;大于100kb的克隆占87 7%,大于110kb的克隆占56%;空载率小于1%。该文库的构建为深入开展棉花基因组有关研究奠定了基础。

马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒（MDV）感染性克隆基因组中细菌人工染色体（BAC）序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9—1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞（CEF）拯救SC9—1重组病毒。将SC9—1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养，利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1～10代不同代次SC9—1重组病毒的DNA作为模板，利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物，以MDV保守基因pp38作为内参，对不同代次病毒基因组中BAc序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9—1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列，通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示，1～5代病毒DNA均能扩增出600bp的特异性目的条带，证实病毒的基因组中含有BAC序列。6～10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带，证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示，病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少，直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中，对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定，结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点，序列同源性均在99．7％以上。结果表明，利用cre／loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDVmeq基因缺失株SC9—1的BAC序列完全敲除掉，且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。

黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库构建

为了开展鲤基因组研究,深入研究遗传连锁图谱遗传标记的定位及数量性状的定位和克隆,并最终为分子育种提供服务,本实验构建了鲤的BAC基因组文库。通过采集黑龙江野鲤(Cyprinus caxpio haematopterus)全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。通过BamHⅠ部分酶切和PFGE电泳分离选择获得100～300kb的DNA片段,用电洗脱和透析的方法对产物进行浓缩和纯化。纯化的HMWDNA连接到大小为7.2kb的克隆载体pEZBAC上。为了评估构建的文库的质量使用一系列引物对文库进行了验证。本研究首次构建黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46656个克隆,插入片段大小在50～300kb之间,平均大小在100kb左右,覆盖鲤全基因组2.45倍,调取任一基因的概率为90%左右。获得的BAC克隆,保存在378块96孔板和27块384孔板中。建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验为今后进一步进行鲤的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要基础。

细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究

基因组文库是进行分子克隆和基因结构与功能研究的基础,完整覆盖的基因组文库的构建,使基因组任何DNA片段的筛选和获得成为可能。细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)与其它载体系统相比具有转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收,高覆盖率、稳定性强,并且具有易分离和操作等特性等优点而被广泛应用。作为物种保护策略的重要部分,构建我国濒危动植物品种基因组BAC文库,对于其遗传资源的保护和研究具有非常重要的作用。在查阅大量国内外相关资料的基础上,就BAC基因组文库构建过程中载体的制备、高分子量DNA的制备、大片段DNA的回收、连接与电击转化、基因组BAC文库质量鉴定等几个重点、难点问题进行了详细的论述和分析,对于构建高分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因组文库提供理论基础与技术支撑。

东乡野生稻双元细菌人工染色体(BIBAC)文库的构建

双元细菌人工染色体(binarybacterialartificialchromosome,BIBAC)是能直接将大片段DNA转入植物的载体,是植物基因图位克隆和构建植物基因嵌入突变体库的重要工具。该研究以东乡野生稻为材料,构建其BIBAC文库。该文库由14592个克隆组成,平均插入片段大小为65kb,覆盖率为2倍基因组。稳定性检测结果表明,东乡野生稻基因组DNA能够在BIBAC载体中稳定存在。

一种新型火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建与鉴定

拟构建一种新型火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组细菌人工染色体(BAC),通过同源重组方法将mini-F载体插入HVT基因组的糖蛋白C(glycoprotein C,gC)基因的等位位点得到mini-F重组HVT,提取重组病毒的DNA转入大肠杆菌DH10B细胞,再转入GS1783细胞获得BAC,拯救病毒获得mini-F重组病毒和gC恢复病毒后,与亲本病毒(HVT FC126)比较生长动力学和对鸡马立克病的免疫效力。结果:获得数个BAC阳性克隆,取其中一个克隆(BAC^(HVT-G))成功拯救出HVT mini-F重组病毒(HVT^(BAC-ΔgC)),并成功获得了gC恢复毒株(HVT^(BAC-gC-R))。生长特性和免疫效力试验表明HVT^(BAC-gC-R)与HVT FC126无显著差异,而HVT^(BAC-ΔgC)增殖能力和免疫效力均明显下降。成功构建了HVT全基因组的感染性BAC;HVT的gC基因是一个非必需基因,但对病毒的增殖能力和免疫效力有重要影响。

石麦15细菌人工染色体文库构建与鉴定

为给小麦功能基因研究提供参考信息,以冬小麦栽培品种石麦15（Triticum aestivum L.）为试材,从暗培养7~10d的黄化幼苗地上部提取高分子量基因组DNA,使用载体pCC1BAC的HindⅢ位点构建了六倍体小麦细菌人工染色体文库。该文库由1 000 000个以上克隆组成,保存在1 020个混合池中,克隆插入片段平均大小为85kb,空载率为2.5%;覆盖小麦基因组5倍以上;挑取7个克隆培养5d后,经HindⅢ完全酶切检测,其指纹图谱稳定一致。石麦15细菌人工染色体文库的构建为小麦基因克隆、调控序列克隆以及比较基因组学研究奠定了基础。

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

以P30A细胞质雄性不育系黄化苗为材料,采用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提取棉花线粒体,低熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体DNA(mtDNA),经BamHⅠ,HindⅢ酶切和PCR扩增进行纯度鉴定,并对其进行部分酶切,酶切片段与载体连接,电击转入大肠杆菌DH10B中,成功的构建了棉花线粒体基因组BAC文库。该文库共挑取3 840个单克隆,平均插入片段大小为15.5 kb,覆盖率超过70倍,研究结果表明该基因文库具有较高的质量。

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有104个克隆的双元细菌人工染色体(BIBAC)基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。

细菌人工染色体的研究和应用

细菌人工染色体 (Bacterialartificialchromosome ,BAC)是第二代大片段DNA的克隆载体系统。因其嵌合率低 ,遗传稳定性好 ,重组DNA容易分离和制备 ,转化效率高等 ,弥补了YAC的不足 ,很快在基因组研究中处于中心地位。近年来 ,已有多种BAC载体被构建出来 ,这些BAC载体在复杂基因组大片段文库的构建 ,基因的图位克隆 ,基因组物理图谱的构建 ,基因和基因组测序 ,基因组织结构分析 ,染色体组织和进化 ,以及基因的遗传转化和调控研究中得到了广泛的应用。