关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究

细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷 ,并结合凝胶回收纯化技术 ,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上 ,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件 ,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间 ,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关键步骤。

细菌人工染色体(BAC)及其分析和修饰方法简介

细菌人工染色体是一种新发展起来的DNA载体系统 ,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点 .在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用 .综述了近年来发展起来的对BAC进行分析和修饰的一些方法 .

云南药用野生稻核基因组细菌人工染色体(BAC)文库的构建与分析

通过云南药用野生稻核基因组BAC文库的构建,保存处于濒危状态的云南药用野生稻遗传资源。该文库包含27500个克隆,随机挑取80个克隆检测,插入片段平均大小为80kb,文库容量相当于水稻基因组大小的5.1倍。

稻瘟病菌细菌人工染色体(BAC)基因组文库的构建

稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌 ,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用 95 - 2 3- 4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA ,用限制性内切酶部分酶解后 ,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接 ,通过转化E .coliDH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了 95 - 2 3- 4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体 (BAC)基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段 2 9.1kb ,该文库覆盖 7.4倍基因组 。

棉花细菌人工染色体的荧光原位杂交(BAC-FISH)技术

细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)技术是植物染色体识别、物理作图等分子细胞遗传学研究的重要工具,但对于某些物种尤其是多倍体植物,由于大量重复序列的存在等问题,使得该技术应用受到很大的限制.通过选择棉花分子遗传图中高重组区的微卫星位点(simple sequence repeats,SSR)标记的策略,筛选到不含或含有少量重复序列的细菌人工染色体(BAC)克隆,同时,在通用FISH技术程序基础上,通过改进发根、变性、洗脱条件等步骤,构建出适合于棉花的BAC-FISH技术,简化了操作流程的同时,获得稳定的杂交结果及较高的检出率;并通过将一随机获得的BAC进行染色体的物理定位,进一步引入双探针、双色及重复杂交技术,显示了该技术的成熟与良好的应用前景和价值.

高产优质抗病棉花品种中棉所12号细菌人工染色体(BAC)文库构建

中棉所12号是我国自育的高产、优质、抗枯萎病、耐黄萎病棉花品种,其重要创新是使抗性和产量、品质得到结合改良和提高。本研究以plndigoBAC-5为载体,对中棉所12号进行了细菌人工染色体(BAC)文库构建。初步建立的文库含有38800个克隆,覆盖2倍基因组。对文库中132个重组克隆的分析表明:插入片段为50～150kb,平均大小为120kb;大于100kb的克隆占87 7%,大于110kb的克隆占56%;空载率小于1%。该文库的构建为深入开展棉花基因组有关研究奠定了基础。

东乡野生稻双元细菌人工染色体(BIBAC)文库的构建

双元细菌人工染色体(binarybacterialartificialchromosome,BIBAC)是能直接将大片段DNA转入植物的载体,是植物基因图位克隆和构建植物基因嵌入突变体库的重要工具。该研究以东乡野生稻为材料,构建其BIBAC文库。该文库由14592个克隆组成,平均插入片段大小为65kb,覆盖率为2倍基因组。稳定性检测结果表明,东乡野生稻基因组DNA能够在BIBAC载体中稳定存在。

高效制备双元细菌人工染色体(BIBAC)载体DNA的研究

高质量的BIBAC载体DNA的制备受到酶切、脱磷等许多因素的影响,是构建BIBAC文库的关键步骤之一.以BIBAC2载体为材料,对其进行了BamHI限制性酶切和CIAP脱磷,制备了可用于进一步构建文库的线性载体.在此基础上确定了适宜的酶量、酶切时间、脱磷酶的用量及失活等步骤的反应条件.

绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化

近年来,细菌人工染色体BAC文库成为应用最广泛的基因组文库之一,它以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等不可比拟的优点而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究之中。作者就细菌人工染色体BAC文库的构建条件进行了研究,用HindⅢ部分酶切绒山羊基因组,脉冲场凝胶电泳分离大片段DNA,以电洗脱法回收DNA后,与BAC载体连接,将连接产物点透析后,电转化DH10B感受态细胞,最后对转化的片段小提质粒进行NotⅠ酶切,脉冲电泳鉴定其大小。结果表明,本试验采用的方法既可获得较大的插入片段又可获得较高的转化效率,是较好的用于构建大基因组文库的方法。

细菌人工染色体(BAC)文库在畜禽遗传资源保存中的应用

作者介绍了国际畜禽遗传资源保存的研究现状与趋势,分析了细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的发展和应用状况,阐述了BAC文库应用于畜禽遗传资源保存的特有优势,提出了建立BAC文库将成为畜禽遗传资源保存的一种重要补充形式,有利于提升畜禽遗传资源保存的安全性和长久性,也为今后进一步研究畜禽品种的特定性状提供了无可替代的材料,对实现全方位保存畜禽遗传资源具有重要的实用价值和推动作用。

利用细菌人工染色体文库(BAC)筛选猪乳蛋白基因

利用猪细菌人工染色体文库 (porcineBacteriaArtificialChromosome ,pBAC)的两步—四维PCR(twostep 4 DPCR)方法筛选猪乳清酸性蛋白 (WheyAcidicProtein ,WAP) ,αsl 酪蛋白 ,αs2 酪蛋白 ,β 酪蛋白 ,κ 酪蛋白的基因pBAC克隆 ,并提出了BAC基因文库一步—五维PCR(onestep 5 DPCR)筛选基因的方法。

细菌人工染色体(BACs)

文章比较了YACs、BACs、PACs和M ACs的主要特点,综述了细菌人工染色体的构建及其在基因组文库构建和基因功能分析等方面的广泛应用.

细菌人工染色体(BAC)文库及其在小麦中的应用

细菌人工染色体(BAC)具有容量大、遗传稳定、易于操作等优点,在基因组研究和基因功能分析等方面得到了广泛应用。对BAC文库克隆载体的类型、小麦BAC文库的构建及其应用进行了综述,并对其前景进行了展望。细菌人工染色体载体是由大肠杆菌的F-因子发展而来,第一代BAC克隆载体pBAC108l能容纳300kb的片段,但它只具有转化选择标记,没有重组选择标记。第二代载体是将LacZ基因插入到多克隆位点中形成具有重组选择标记类型的载体如pBeloBAC11,在该载体的基础上经过改造和改进又发展了一些特殊用途的载体,如富集基因类型和遗传转化类型的载体。近年来利用这些载体构建了小麦二倍体、四倍体、六倍体基因组BAC文库以及小麦特定染色体BAC文库,并以单克隆或混合池的形式保存。这些小麦BAC文库对于小麦基因克隆、基因组及基因区物理图谱的构建以及比较基因组学等方面的研究具有重要的意义。

羊莫氏巴贝斯虫细菌人工染色体(BAC)文库的构建

为丰富巴贝斯虫基因组信息,选用感染中国羊的莫氏巴贝斯虫临潭株(Babesia motasi Lintan)为对象,将纯化的红细胞阶段虫体裂殖子包埋于低熔点琼脂糖,用蛋白酶K进行消化处理,得到巴贝斯虫基因组DNA,利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离大片段基因组DNA,将其与CopyControl pCC1BAC Cloning—ready Vector进行连接并转化到EPI300^(TM)Escherichia coli感受态细胞,成功构建了含有34 560个克隆的莫氏巴贝斯虫临潭株基因组细菌人工染色体(BAC)文库;文库的平均插入片段大小为70 kb,基因组覆盖度为×137,空载率均低于3%,且克隆稳定。该BAC文库的构建,为进一步绘制精细物理图谱、基因组测序、进化及利用比较基因组学筛选致病基因等方面的研究奠定了基础。

基因组细菌人工染色体文库(BAC)的构建及应用

细菌人工染色体 (BAC)是一种承载DNA大片段的克隆载体系统 ,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础 ,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。本文主要综述了细菌人工染色体的构建与其鉴定 ,及其在物理图谱构建、图位克隆、转基因技术等研究上的应用。

黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库构建

为了开展鲤基因组研究,深入研究遗传连锁图谱遗传标记的定位及数量性状的定位和克隆,并最终为分子育种提供服务,本实验构建了鲤的BAC基因组文库。通过采集黑龙江野鲤(Cyprinus caxpio haematopterus)全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。通过BamHⅠ部分酶切和PFGE电泳分离选择获得100～300kb的DNA片段,用电洗脱和透析的方法对产物进行浓缩和纯化。纯化的HMWDNA连接到大小为7.2kb的克隆载体pEZBAC上。为了评估构建的文库的质量使用一系列引物对文库进行了验证。本研究首次构建黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46656个克隆,插入片段大小在50～300kb之间,平均大小在100kb左右,覆盖鲤全基因组2.45倍,调取任一基因的概率为90%左右。获得的BAC克隆,保存在378块96孔板和27块384孔板中。建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验为今后进一步进行鲤的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要基础。

棉花细菌人工染色体文库构建的方法优化

以我国抗病、优质、丰产的棉花优良品种中棉所12号为材料,对棉花细菌人工染色体(BAC)文库构建过程中的一些关键技术,如plug的制备、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入片段与载体的摩尔比值、连接产物的浓缩等进行了研究,建立了构建棉花BAC文库的适宜方法体系。依照该方法初步构建了含有38000个克隆的棉花BAC文库。经检测,插入片段平均大小约为120kb,蓝斑率小于0.5%,空载率小于1%。插入片段与载体的最适摩尔比为1∶15,一次转化可以获得约2000个克隆,cfu·μl 1高达4。该方法为进一步构建中棉所12号多倍基因组的BAC文库、从而进行棉花基因组有关研究奠定了基础。

火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建

火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。【目的】本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)。【方法】利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和BAC载体pBeloBAC11的基本功能序列,构建重组病毒转移载体pGAB-gpt-BAC11。通过将pGAB-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病毒噬斑后,利用霉酚酸(MPA)阻断核酸代谢途径,经过筛选获得纯化的重组病毒purified-rHVT。提取purified-rHVT感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆,并用酶切和PCR方法对其进行鉴定。随机选取BAC克隆提取BACDNA转染次代CEF,完成HVT重组病毒的拯救。【结果】经过6轮筛选后获得纯化的重组病毒,并筛选到25个BAC分子克隆化病毒。其中BAC6、BAC8和BAC10再次启动病毒感染,产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态,说明已经获得拯救出的HVT重组病毒。【结论】本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体,建立了HVT反向遗传操作技术平台。