基于细菌体系生产双链RNA的条件优化

化学杀虫剂是农业害虫防治的主要手段,然而农业害虫已对化学杀虫剂产生了抗药性。RNA农药的应用将是减少使用化学杀虫剂的一种途径。RNA农药具有专一、高效、易降解和对环境友好等优点而受到了关注,但在靶标分子、靶标分子的双链RNA(dsRNA)生产工艺和应用制剂等方面仍需进一步研究。本研究以褐飞虱Nilaparvata lugens蛋白激酶B基因的dsRNA(dsNlAKT)为例,对利用细菌体系生产dsRNA的方法进行了探究。将NlAKT构建进L4440载体后,将其转化到缺乏核酸酶(RNaseⅢ)的大肠杆菌Escherichia coli HT115(DE3)中,进行了dsRNA生产条件的测试。结果表明:(1)当异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)工作浓度为0.1 mM或0.5 mM时dsRNA的产量没有明显变化,而当其工作浓度增加至1 mM时dsRNA产量明显减少;(2)在IPTG诱导时间为2~8 h范围内,添加IPTG后诱导6 h获得的dsRNA产量最多;(3)在实验室常规提取RNA方法中,增加低剂量溶菌酶预处理这一步骤可增加提取产物中dsRNA的含量。试验结果证明了采用工作浓度为0.1 mM的IPTG诱导6 h的生产条件,并在提取过程中增加溶菌酶的预处理步骤有助于获得较高的dsRNA含量。研究结果为RNA农药的生产条件提供了实验依据。

细菌细胞表面展示体系提呈人源诺如病毒(GⅡ.4)抗原效果的评价

人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是重要的肠胃炎病毒之一,造成了全球巨额经济负担,故其防控成为研究热点。探究不同形式的免疫原对机体体液和粘膜免疫的激发效果,成为HuNoVs疫苗研发的一个突破口。本研究利用前期以细菌细胞表面展示体系构建的假HuNoVs(GⅡ.4)和纯化的P(GⅡ.4)蛋白为对象,乳化后每隔两周分别进行Balb/C小鼠皮下多点和口服免疫,并以间接酶联免疫吸附试验测定血清中抗体的消长规律。同时,以磷酸盐缓冲液作为对照。抗体效价测定结果显示:皮下免疫组的假HuNoVs(GⅡ.4)可以有效激发小鼠体液免疫,其效价稍低于以P(GⅡ.4)蛋白作为抗原免疫获得的抗体。经过5次免疫后,血清中IgG抗体效价基本趋于稳定。但是,假HuNoVs(GⅡ.4)和P(GⅡ.4)蛋白的口服免疫组血清中均未测到IgA和IgG抗体。因此,细菌细胞表面展示体系假HuNoVs(GⅡ.4)可以作为HuNoVs疫苗候选抗原的提呈体系,为该病毒的疫苗研发提供借鉴。