利用细菌双杂交文库筛选华癸中慢生根瘤菌7653R中与外膜蛋白Opa22互作的蛋白

为研究华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R外膜蛋白Opa22在共生固氮过程中的作用机制,构建了细菌双杂交基因组随机文库,并以Opa22为诱饵,钓取与其相互作用的候选靶蛋白。结果获得12个与Opa22蛋白互作的阳性克隆,为后续研究Opa22的作用机制提供了新的线索和思路,同时也为开展根瘤菌蛋白互作的研究构筑了良好的技术平台。

细菌双杂交验证古菌UDG与TRX相互作用的研究

目的验证别府硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii,S.tokodai)i DNA碱基切除修复中重要的酶-尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase,StoUDG)与硫氧还蛋白(thioredoxin,StoTRX)之间的相互作用,方法将StoUDG和StoTRX的基因分别克隆到细菌双杂交载体上,共转化至报告菌株,从筛选平板上检测StoUDG和StoTRX相互作用的强弱.结果 (1)pBT-TRX与pTRG-UDG等细菌双杂交质粒共转化至报告菌株,可使报告菌株在含氯霉素、四环素和卡那霉素的LB平板上生长;(2)含pBT-TRX与pTRG-UDG质粒的细菌双杂交报告菌株可在筛选平板上缓慢生长,且不发生自激活.结论 StoUDG与StoTRX存在较弱的相互作用,提示StoTRX参与依赖于StoUDG的DNA碱基切除修复过程,

细菌双杂交系统及其在病原微生物学中的应用

细菌双杂交系统是一种用于体内研究蛋白质之间相互作用的有力工具。近年来,新的细菌双杂交系统被不断地开发,并被广泛地应用于病原微生物基因产物功能和致病机制研究。本文主要就细菌双杂交系统的原理与分类,在对病原微生物蛋白质之间相互作用的识别与作用域作图、基因组范围的蛋白质之间相互作用图谱的描绘、基因工程和药物的开发中的应用以及其优缺点等方面进行综述。

花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建

初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明:花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示:所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。

LSPA1早期基因gp22细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立

构建细菌双杂交系统中的诱饵载体p KT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因,插入p KT25构成诱饵质粒p KT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到p UT18C质粒的Bam HⅠ位点,获得基因组DNA表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与p UT18C共转入BTH101,检测诱饵质粒自激活作用,并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至JM109感受态,PCR鉴定文库的多样性。诱饵载体p KT25-gp22无自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达8倍,满足文库筛选需要。成功构建细菌双杂交系统中诱饵载体p KT25-gp22,筛选文库质量良好,可应用于细菌双杂交实验。

细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用中的应用

目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性。方法:应用Stratagene BacterioMatch two hy-brid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒。重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF,报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标。结果:pTRG-TRAIL与pBT-DR4,pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500μg/ml以上)筛选下宿主菌呈转录激活状态,pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250μg/ml以下)筛选下宿主菌呈转录激活状态,用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2,pBT-DR4、pBT-DR5或pBT-OPG与pTRG-Gal114组共转化后呈阴性。结论:所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域,而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证,所以细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究。

对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组细菌双杂交系统的构建

细菌双杂交系统是新近建立的一种研究蛋白质间相互作用的方法.应用细菌双杂交系统,分别以pBT、pTRG诱饵质粒构建编码WSSV基因组DNA随机片段的融合表达质粒pBT-wssv、pTRG-wssv.重组质粒共转化双杂交报告菌株XLl-Blue MRF′,通过LB-TCK平板筛选对虾白斑综合征病毒中有相互作用的蛋白质.本研究中我们构建了WSSV基因组细菌双杂交系统,用于筛选WSSV中有相互作用的蛋白,为该病毒功能基因组的研究打下良好的基础.

长双歧杆菌抗毒素基因mazE细菌双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

目的构建细菌双杂交系统中的诱饵载体pBT-mazE，为长双歧杆菌的压力调控机制研究奠定基础。方法PCR扩增抗毒素蛋白MazE的编码基因，插入到带有XcI基因的载体pBT构建诱饵质粒pBT-mazE。将pBT-mazE转化至大肠杆菌报告菌株XL-1 BlueMRF’Kan，检测诱饵蛋白maze-λcI的表达。将pBT-mazE和pTRG空载体共转化报告菌株XL-1 BlueMRF’Kan，通过3-氨基-1，2，4-三氮唑（3-amino-1，2，4-triazole，3-AT）选择性筛选平板检测诱饵质粒的自激活作用。结果酶切和测序结果显示MazE蛋白编码序列成功克隆入载体pBT，融合区读码框正确。诱饵质粒pBT-mazE能够表达诱饵蛋白maze-λcI。pBT-mazE和pTRG空载体共转化的报告菌株XL-1 BlueMRF’Kan在含有3-AT的选择性筛选平板上无菌落生成，而在no3-AT非选择性筛选平板上生长良好，表明诱饵质粒pBT-mazE在细菌双杂交系统中无自激活作用。结论所构建的诱饵载体pBT-mazE可以用于细菌双杂交的进一步实验。

细菌双杂交筛选肿瘤细胞中与人生物钟蛋白PER1相互作用的蛋白

目的筛选肿瘤细胞中与生物钟分子振荡系统的重要组成部分PERl蛋白（period circadian protein homolog1）相互作用的蛋白质分子，为生物钟基因在肿瘤发生发展过程中的功能研究提供条件。方法应用细菌双杂交技术与人宫颈癌Hela细胞cDNA文库，以pBT为载体，构建pBT-PERl融合表达诱饵质粒，与pTRG连接的人宫颈癌HeIa细胞cDNA文库质粒共转化双杂交系统报告菌株，利用培养基的特殊选择性，筛选出阳性克隆并测序分析。结果筛选出14个蛋白编码基因，其中4个包含完整的蛋白编码序列，包括与线粒体动力学相关的OPA3蛋白，与铜代谢相关的CUTA蛋白，与细胞运动、定位等细胞事件相关的蛋白，与物质合成、代谢等生物化学反应相关的蛋白，还有在信号转导中发挥作用的相关蛋白。结论肿瘤细胞中与PER1蛋白存在潜在相互作用新蛋白的筛选和鉴定为研究人生物钟基因PERI在肿瘤发生发展中的功能提供了条件。

细菌双杂交系统筛选与tumstatin45-132相互作用蛋白质

目的 筛选与新生血管抑制剂肿瘤抑素功能性片段tumstafin45．132相互作用的蛋白质分子。方法 构建诱饵蛋白载体pBT-tumstatin45-132，通过细菌双杂交系统筛选人肝细胞eDNA文库；克隆表达MBP-tumstafin45-132及候选蛋白His-MMP-2，利用MBPpull-downassay和蛋白质印迹方法验证pBT-tumstafin45-132与候选蛋白MMP-2间的相互作用。结果 pBT-tumstafin45-132无自身转录激活活性，筛选人肝细胞eDNA文库，获得25个双阳性克隆，序列分析和同源检索表明所获其中之一候选蛋白为基质金属蛋白酶MMP-2；MBP pull-downassay和蛋白质印迹方法验证了pBT-tumstatin45．132与候选蛋白MMP-2间确实存在相互作用。结论 这些结果为进一步研究tumstatin 45-132新的功能和机制创造了条件。

红莲型杂交水稻细菌双杂交系统文库的构建

用Trizol试剂提取红莲型水稻杂种F1幼穗的总RNA,分离纯化mRNA后反转录并合成双链cDNA.经Sephrose CL-2B凝胶过滤柱层析后,收集大于400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接到pTRG载体上,转化到XL1-Blue MRF′Kan感受态细胞后构建成红莲水稻幼穗细菌双杂交文库.经检测计算该原始文库容量为1.03×106pfu/mL,对随机挑取的100个克隆进行PCR鉴定显示重组率接近100%而且大于800 bp的插入片段达到97%.扩增后文库的容量达到1.05×1010pfu/mL.

细菌双杂交筛选大豆GmWNK1互作蛋白系统的建立及应用

本研究利用大肠杆菌双杂交系统构建了一个高质量的大豆根系cDNA文库,同时利用大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建了融合表达质粒pBT-GmWNK1,经酶切和测序鉴定、诱饵融合蛋白的表达检测及诱饵融合蛋白的自激活鉴定后作为诱饵,从大豆根部cDNA文库中筛选与GmWNK1发生互作的蛋白质,共获得18个阳性克隆。经测序和同源性比对发现,有10个阳性克隆编码已知蛋白,8个为假阳性。研究结果为揭示WNK基因家族的生物学功能和调控机制提供了重要的参考数据和研究材料。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank No.HQ342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。

细菌双杂交系统的改进

解析蛋白质之间的相互作用,对理解调控和代谢等生物学过程具有重要意义。其中基于互补腺苷酸环化酶功能的细菌双杂交系统是一种研究蛋白质之间相互作用的有效手段。本文在利用该系统时发现存在假阳性高的缺陷。进一步报告基因活性分析表明产生假阳性的原因是不同克隆的生理状态影响了LacZ的输出,即lacZ启动子除了受cAMP信号分子的控制,还受到其他调控蛋白的直接或间接的调控。为了降低生理因素对报告基因的影响,我们向该系统引入用多拷贝lacZ启动子控制的gfp报告基因。这不仅通过增加lacZ启动子的数量,弱化了生理因素的影响;还实现了第二个报告基因gfp与lacZ同时报告蛋白质之间的相互作用情况,提高了输出的准确性。系统的实验验证表明,我们改进的细菌双杂交系统的灵敏性确实得到大幅提高。

双杂交和质谱技术在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的应用

基因的功能是由蛋白质来执行的,而蛋白质要通过与其他生物分子相互作用来完成其各种生物功能。因此,如果能够快速做出蛋白质在不同时间、空间和不同环境中的相互作用图谱,就会帮助我们了解这些蛋白质的功能,进而了解许多生命活动的机制。目前,用于大规模研究蛋白质间相互作用的方法主要有酵母双杂交系统及其衍生系统、亲和纯化与质谱分析联用技术,前者用于研究蛋白分子间的两两相互作用,后者用于研究蛋白质复合物间的相互作用。本文主要阐述了酵母双杂交、细菌双杂交、哺乳动物细胞双杂交、亲和纯化与质谱联用技术在大规模蛋白质相互作用研究中的应用。

铜绿假单胞菌pcr2基因功能的研究

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)是铜绿假单胞菌的重要致病因子,pcr2基因位于TTSS基因簇中popN操纵子的第三位,有关该基因的具体功能研究还是空白。首先,本研究采用定点诱变方法构建pcr2-突变体,发现TTSS表达和分泌ExoS和ExoT蛋白的能力显著下降,在HeLa细胞感染实验中,ExoS和ExoT蛋白注入细胞的数量明显低于野生型菌株。其次,我们采用细菌双杂交系统研究了Pcr2蛋白与其它蛋白结合的可能性,发现Pcr2蛋白与PscB蛋白一起能够结合PopN蛋白,同时Western blot实验发现Pcr2蛋白能够调控PopN蛋白的分泌。最后,实验发现Pcr2蛋白本身也能够分泌到细胞外,可能与TTSS分泌器的早期形成过程有关。

禽流感病毒NS1蛋白与鸡LY6E蛋白间的相互作用

利用细菌双杂交系统,研究了禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)非结构蛋白(Nonstructurol1protein,NS1)和鸡淋巴细胞抗原复合体(LY6E)蛋白之间的相互作用。用RT-PCR方法克隆了AIV NS1基因和鸡LY6E基因的全长开放阅读框,将其克隆于细菌双杂交系统中的2个质粒中,成功构建了重组诱饵质粒pBT/NS1和重组目标质粒pTRG/LY6E。SDS-PAGE电泳表明,IPTG诱导后它们均得到正确表达。将重组质粒pBT/NS1和pTRG/LY6E共转化报告菌株,获得的阳性共转化子在含有3-AT和链霉素的组氨酸缺失的M9+筛选培养基上生长,表明AIV NS1蛋白和鸡LY6E蛋白之间存在相互作用,为AIV致病机制的研究提供了新的资料。

猪CFTR基因特异性锌指核酸酶的筛选与鉴定

【目的】获得靶向猪囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regu-lator,CFTR)基因的特异锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN),为建立CFTR基因敲除猪细胞系提供技术支持。【方法】通过开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选,首先以已知三锌指蛋白为框架,随机突变单个锌指关键位点氨基酸编码序列,建立人工三锌指蛋白随机库;然后应用细菌双杂交技术,从库中筛选出能够结合CFTR基因靶位点的三锌指蛋白;最后将获得的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ组装成特异ZFN,通过酵母验证体系,检测ZFN靶向切割其识别序列的效率。【结果】获得3个人工三锌指蛋白随机库,每个库约含有2×106个单克隆,通过2轮细菌双杂交筛选,分别获得48个针对CFTR基因左右两侧靶位点的三锌指蛋白。ZFN活性验证结果表明,约90%的ZFN能够在酵母细胞内实现靶向切割,获得了高效特异的ZFN。【结论】获得了猪CFTR基因高效特异的ZFN。

人巨细胞病毒UL123基因外显子4诱饵质粒的构建与鉴定

目的构建和鉴定人巨细胞病毒(HCMV)UL123基因外显子4(ie1-exon4)的诱饵质粒,并评价其用于细菌双杂交系统筛选文库的可行性。方法以重组质粒pTWIN1/ie1为模板扩增ie1-exon4,克隆入pBT质粒,转化E.coliXL1-BlueMRF’Kan,经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子,提取阳性重组质粒,再转化入细菌双杂交系统报告菌株,诱导表达重组融合蛋白,用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,并进一步鉴定重组子自身激活作用。结果细菌双杂交诱饵质粒pBT/ie1-exon4构建成功,并在报告菌株中表达了重组融合蛋白rIE1-C86-491/λC1,且pBT/ie1-exon4无自身激活作用。结论成功构建了无自激活作用的诱饵质粒pBT/ie1-exon4,可用于筛选文库。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成。结论利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽。