细菌双杂交系统及其在病原微生物学中的应用

细菌双杂交系统是一种用于体内研究蛋白质之间相互作用的有力工具。近年来,新的细菌双杂交系统被不断地开发,并被广泛地应用于病原微生物基因产物功能和致病机制研究。本文主要就细菌双杂交系统的原理与分类,在对病原微生物蛋白质之间相互作用的识别与作用域作图、基因组范围的蛋白质之间相互作用图谱的描绘、基因工程和药物的开发中的应用以及其优缺点等方面进行综述。

细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用中的应用

目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性。方法:应用Stratagene BacterioMatch two hy-brid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒。重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF,报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标。结果:pTRG-TRAIL与pBT-DR4,pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500μg/ml以上)筛选下宿主菌呈转录激活状态,pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250μg/ml以下)筛选下宿主菌呈转录激活状态,用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2,pBT-DR4、pBT-DR5或pBT-OPG与pTRG-Gal114组共转化后呈阴性。结论:所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域,而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证,所以细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究。

红莲型杂交水稻细菌双杂交系统文库的构建

用Trizol试剂提取红莲型水稻杂种F1幼穗的总RNA,分离纯化mRNA后反转录并合成双链cDNA.经Sephrose CL-2B凝胶过滤柱层析后,收集大于400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接到pTRG载体上,转化到XL1-Blue MRF′Kan感受态细胞后构建成红莲水稻幼穗细菌双杂交文库.经检测计算该原始文库容量为1.03×106pfu/mL,对随机挑取的100个克隆进行PCR鉴定显示重组率接近100%而且大于800 bp的插入片段达到97%.扩增后文库的容量达到1.05×1010pfu/mL.

细菌双杂交系统的改进

解析蛋白质之间的相互作用,对理解调控和代谢等生物学过程具有重要意义。其中基于互补腺苷酸环化酶功能的细菌双杂交系统是一种研究蛋白质之间相互作用的有效手段。本文在利用该系统时发现存在假阳性高的缺陷。进一步报告基因活性分析表明产生假阳性的原因是不同克隆的生理状态影响了LacZ的输出,即lacZ启动子除了受cAMP信号分子的控制,还受到其他调控蛋白的直接或间接的调控。为了降低生理因素对报告基因的影响,我们向该系统引入用多拷贝lacZ启动子控制的gfp报告基因。这不仅通过增加lacZ启动子的数量,弱化了生理因素的影响;还实现了第二个报告基因gfp与lacZ同时报告蛋白质之间的相互作用情况,提高了输出的准确性。系统的实验验证表明,我们改进的细菌双杂交系统的灵敏性确实得到大幅提高。

长双歧杆菌抗毒素基因mazE细菌双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

目的构建细菌双杂交系统中的诱饵载体pBT-mazE，为长双歧杆菌的压力调控机制研究奠定基础。方法PCR扩增抗毒素蛋白MazE的编码基因，插入到带有XcI基因的载体pBT构建诱饵质粒pBT-mazE。将pBT-mazE转化至大肠杆菌报告菌株XL-1 BlueMRF’Kan，检测诱饵蛋白maze-λcI的表达。将pBT-mazE和pTRG空载体共转化报告菌株XL-1 BlueMRF’Kan，通过3-氨基-1，2，4-三氮唑（3-amino-1，2，4-triazole，3-AT）选择性筛选平板检测诱饵质粒的自激活作用。结果酶切和测序结果显示MazE蛋白编码序列成功克隆入载体pBT，融合区读码框正确。诱饵质粒pBT-mazE能够表达诱饵蛋白maze-λcI。pBT-mazE和pTRG空载体共转化的报告菌株XL-1 BlueMRF’Kan在含有3-AT的选择性筛选平板上无菌落生成，而在no3-AT非选择性筛选平板上生长良好，表明诱饵质粒pBT-mazE在细菌双杂交系统中无自激活作用。结论所构建的诱饵载体pBT-mazE可以用于细菌双杂交的进一步实验。

铜绿假单胞菌pcr2基因功能的研究

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)是铜绿假单胞菌的重要致病因子,pcr2基因位于TTSS基因簇中popN操纵子的第三位,有关该基因的具体功能研究还是空白。首先,本研究采用定点诱变方法构建pcr2-突变体,发现TTSS表达和分泌ExoS和ExoT蛋白的能力显著下降,在HeLa细胞感染实验中,ExoS和ExoT蛋白注入细胞的数量明显低于野生型菌株。其次,我们采用细菌双杂交系统研究了Pcr2蛋白与其它蛋白结合的可能性,发现Pcr2蛋白与PscB蛋白一起能够结合PopN蛋白,同时Western blot实验发现Pcr2蛋白能够调控PopN蛋白的分泌。最后,实验发现Pcr2蛋白本身也能够分泌到细胞外,可能与TTSS分泌器的早期形成过程有关。

人巨细胞病毒UL123基因外显子4诱饵质粒的构建与鉴定

目的构建和鉴定人巨细胞病毒(HCMV)UL123基因外显子4(ie1-exon4)的诱饵质粒,并评价其用于细菌双杂交系统筛选文库的可行性。方法以重组质粒pTWIN1/ie1为模板扩增ie1-exon4,克隆入pBT质粒,转化E.coliXL1-BlueMRF’Kan,经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子,提取阳性重组质粒,再转化入细菌双杂交系统报告菌株,诱导表达重组融合蛋白,用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,并进一步鉴定重组子自身激活作用。结果细菌双杂交诱饵质粒pBT/ie1-exon4构建成功,并在报告菌株中表达了重组融合蛋白rIE1-C86-491/λC1,且pBT/ie1-exon4无自身激活作用。结论成功构建了无自激活作用的诱饵质粒pBT/ie1-exon4,可用于筛选文库。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成。结论利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽。

可卡因苯丙胺调节转录肽相互作用蛋白的筛选

目的寻找可卡因苯丙胺调节转录肽(CART)受体或与其相互作用的蛋白。方法建立大鼠脑cDNA文库,以CART为诱饵,应用细菌双杂交方法筛选与CART相互作用的蛋白。结果成功构建大鼠脑pTRG-cDNA文库及诱饵质粒pBT-CART41-102。文库容量为3.37×106,重组率98.5%。筛选约5.01×106个共转化克隆,证实为阳性克隆93个,全部DNA测序。经生物信息学方法分析得到stathm in等6个可能与CART相互作用的蛋白,并得到可能与CART相互作用的未知新蛋白,它们与22个已知膜蛋白或受体有短的极相似片段。结论CART可能与stathmin等6个已知蛋白相互作用,并可能与一些未知蛋白相互作用,这些未知蛋白与22个膜蛋白或受体有短的相似保守结构。