对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组细菌双杂交系统的构建

细菌双杂交系统是新近建立的一种研究蛋白质间相互作用的方法.应用细菌双杂交系统,分别以pBT、pTRG诱饵质粒构建编码WSSV基因组DNA随机片段的融合表达质粒pBT-wssv、pTRG-wssv.重组质粒共转化双杂交报告菌株XLl-Blue MRF′,通过LB-TCK平板筛选对虾白斑综合征病毒中有相互作用的蛋白质.本研究中我们构建了WSSV基因组细菌双杂交系统,用于筛选WSSV中有相互作用的蛋白,为该病毒功能基因组的研究打下良好的基础.

hPer_1bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建hPer1bHLH PAS结构域的酵母双杂交系统 ,以寻找与hPer1相互作用的新蛋白。方法构建pGBKT7 hPer1bHLH PAS重组诱饵质粒及 pGADT7 Rec 脑cDNA文库质粒 ;将两种质粒顺序转染至酵母细胞AH1 0 9中 ,进行营养缺陷筛选阳性克隆株。结果经酶切和基因测序鉴定 ,证实重组诱饵质粒 pGBKT7 hPer1bHLH PAS构建成功。脑cDNA文库转化效率为 1 .2× 1 0 6/3μgpGADT7 Rec。结论 酵母双杂交文库筛选得到 2 4个阳性克隆。这为寻找脑组织中与hPer1相互作用的未知蛋白奠定了基础。

稻瘟菌蛋白激发子在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。

雄激素受体相关蛋白267-α酵母双杂交诱饵重组质粒的构建及转化

目的 构建和转化雄激素受体相关蛋白 2 67 α(ARA2 67 α)的酵母诱饵重组质粒 ,为通过酵母双杂交研究ARA2 67 α的功能奠定基础。方法 用PCR扩增ARA2 67 α全长cDNA中编码PWWP和PHD SET蛋白结构域的两个基因片段 ;将基因片段与 pGBKT7载体定向重组 ;用酶切和测序鉴定重组质粒 ;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入AH 10 9酵母菌株。结果 成功构建pGBKT7 PWWP和 pGBKT7 PHDSET重组质粒。分别转化有 2种重组质粒和pGBKT7空载体的3种AH10 9酵母都能在SD/ Trp/X α gal培养基中长成白色菌落 ,但都不能在SD/ His/ Trp/2 .5mmol/L 3 AT/X α gal和SD/ Ade/ Trp/X α gal培养基中生长 ,在SD/ Trp液中培养 16h后 ,A60 0均值分别为 0 .8、0 .9、0 .9。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活HIS3、ADE2和MEL1酵母报告基因表达的活性 ,也没有酵母毒性作用。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank No.HQ342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。

基于OBE成果导向教育理念的中医药院校学生实践创新能力培养研究

生物化学作为一门实验性学科,在加强中医药院校人才综合能力培养方面具有举足轻重的作用。但传统的生物化学实验大部分以单纯的理论课验证性实验为主,缺乏综合设计性实验,且各项实验相对孤立,缺乏系统性和完整性,学生很难将所掌握的知识融会贯通。文章探讨基于OBE理论的靶向肽适体药物筛选的前期科研实验“病原细菌重要靶标基因克隆及细菌双杂交诱饵重组质粒构建”的教学效果,包括金黄色葡萄球菌DNA的提取和纯度鉴定、目的基因生物信息学分析、目的基因PCR扩增及产物回收纯化、重组质粒构建及鉴定,结果显示,促进了学生对生物化学理论知识的巩固,培养了学生的实验操作能力、团队协作能力、生物信息分析能力,以及实践创新和主观能动性,对培养具有一定科研能力的中医药综合人才具有重要意义。