表皮生长因子受体为靶向重组T7噬菌体抗肿瘤疫苗的构建

目的:构建表皮生长因子受体(EGFR)为靶向的重组T7噬菌体抗肿瘤疫苗。方法:通过RT-PCR克隆EGFR基因膜外DNA片段,经测序鉴定正确,亚克隆3个不同的DNA片段插入T7噬菌体载体,构建重组T7噬菌体。用PCR、SDS-PAGE和Western印迹法鉴定构建的重组T7噬菌体。结果:目的DNA片段以融合蛋白形式表达,展示于噬菌体壳蛋白,Western印迹显示实验组重组T7噬菌体呈阳性信号。结论:构建的重组T7噬菌体融合表达了外源目的多肽,并保持了原有的功能活性。

T7 RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定

目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1(+)。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1(+)/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。

噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白

目的利用T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白。方法构建3A蛋白的原核表达载体,表达并纯化3A蛋白,以3A蛋白为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到产物进行DNA序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了3A蛋白,经过4轮筛选后,选择37个阳性克隆,采用T7特异性引物扩增插入片段,将PCR产物送公司进行测序。经过同源性分析,确定了2个与人肠道病毒3A蛋白相互作用蛋白。结论通过T7噬菌体展示技术可以得到与3A蛋白相互作用蛋白,通过研究此蛋白的功能就可以初步推测出3A蛋白可能的功能,为进一步研究人肠道病毒的致病机制鉴定了基础。

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白

目的利用T7噬菌体展示技术筛选与乙型肝炎病毒X蛋白相互作用的蛋白。方法构建X蛋白的原核表达载体,表达并纯化X蛋白,以X蛋白作为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了X蛋白,经过4轮筛选后,选择52个阳性克隆,采用T7特异性引物扩增插入片段,回收PCR产物进行测序。经过同源性分析,确定了7个与乙型肝炎X蛋白相互作用的蛋白。结论 T7噬菌体展示筛选是1种快速、简单的筛选蛋白质相互作用的工具,筛选的与X蛋白相互作用蛋白为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础。

肾癌T7噬菌体展示肽库构建的实验研究

目的：构建肾细胞癌T7噬菌体展示肽库,为下一步筛选肾癌早期诊断分子标志群打下基础。方法：用传统Trizol方法分别抽取31例涵盖各种组织类型肾癌组织标本的总RNA,确定完整性后再根据OD值等量混合总RNA,用试剂盒完成mRNA的分离并电泳检测其质量,经反转录、末端平齐、片段长短筛选、加接头、双酶切、去除多余接头和〈300 bp的cDNA片段等步骤,再与T7Select10-3b载体连接、体外包装并扩增得到肾癌T7噬菌体展示cDNA文库。通过铺平板测定和PCR技术鉴定所建文库质量。结果：建成原始文库的库容量为5.0×10^7pfu/mL,扩增后文库滴度为3.5×10^12pfu/mL,重组率为95%,插入片段为300-2 000 bp。结论：成功用T7噬菌体构建了高质量的肾癌cD-NA文库,为筛选可用于临床早期诊断的肾癌特异标志奠定基础。

小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库的构建

目的构建小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库。方法用Trizol试剂提取原代小鼠神经细胞总RNA,分离、纯化mRNA,经反转录合成其双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,以形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端的双链cDNA。经Mini Column进行纯化,收集大小在300 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于含有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体上,体外包装后经BLT5403菌株增殖,进行文库扩增。结果所构建的文库库容量为含有3.04×107个重组子,原始滴度为2.8×107 pfu/ml,重组率为92%,扩增后文库滴度为3.5×1010 pfu/ml。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,88%的插入片段大于300 bp。结论 成功构建了小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库。