细菌外膜蛋白质生成途径中膜间质运输的两个模型及思考

革兰氏阴性菌的细胞外膜系统对于细菌的入侵、生存以及抵抗不同恶劣环境起到非常重要的作用。β-桶外膜蛋白质作为革兰氏阴性菌外膜系统上的主要蛋白质,除了能够构成稳定的外膜系统结构之外,还具有很多重要的功能,因此β-桶外膜蛋白质的合成对于细菌来说,也是生存至关重要的。本文总结了目前对细菌外膜蛋白质生成途径中关键步骤,即膜间质运输的两个模型,并针对目前研究结果进行深入剖析及思考。

羊布鲁氏菌外膜蛋白质的组成鉴定

目的:通过蛋白质组技术阐明羊布鲁氏菌外膜蛋白的主要组成。方法:提取并纯化羊布鲁氏菌的外膜蛋白,应用双向电泳技术进行分离,选取双向电泳图上主要的蛋白点进行质谱分析,同时主要蛋白质点的肽指纹图谱利用Mascot在NCBInr蛋白数据库中进行检索。结果:共鉴定到67个蛋白点,主要外膜蛋白为Omp25和Omp31,其他外膜蛋白如Imp、Frp、GroEL等,功能涉及物质运输、能量代谢、应激等。结论:对主要外膜蛋白Omp25和Omp31的识别与分析不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的研究,而且为布鲁氏菌病的疫苗研制提供靶标蛋白。

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

外膜蛋白疫苗对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的：研究幽门螺杆菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）外膜蛋白（ＯＭＰ）加大肠杆菌不耐热内毒素（ＬＴ）经口免疫对小鼠Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ感染的保护作用。探讨定量细菌培养在疫苗免疫效果评价中的应用。方法：从Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ ＮＣＴＣ１１６３７菌株制备ＯＭＰ和全菌超声粉碎抗原，ＬＴ作为粘膜免疫佐剂。通过灌胃分别以Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ全菌超声粉碎抗原１ｍｇ加ＬＴ １０μｇ（Ａ组）、Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ ＯＭＰ ０．５ ｍｇ加ＬＴ １０μｇ（Ｂ组）和生理盐水（Ｃ组）免疫小鼠（ｎ＝３０），每周１次，共４次。免疫完成后４周以Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ Ｓｙｄｎｅｙ Ｓｔｒａｉｎ１菌株攻击小鼠１次（１×１０７ ＣＦＵ／只），攻击后４周处死小鼠，取胃分别作快速尿素酶试验、病理检查及定量细菌培养，观察Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ定植情况。结果： Ｃ组小鼠Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ定植密度为２．４０×１０７ＣＦＵ／ｇ胃组织，Ａ组和Ｂ组小鼠分别为２．０３×１０５ ＣＦＵ／ｇ和６．７６×１０５ＣＦＵ／ｇ胃组织，免疫组的定植密度明显降低。结论：口服Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ ＯＭＰ加ＬＴ对小鼠Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ感染具有一定免疫保护作用，但不能完全预防感染，需进一步筛选更为有效的抗原和佐剂。定量细菌培养可以?

外膜蛋白OprD2缺失和金属酶产生在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中的作用

采用K-B法测定10种抗菌药物对44株铜绿假单胞菌的体外抗菌活性,使用双纸片协同试验进行金属酶筛选,用PCR方法对耐药基因OprD2、IMP和VIM基因进行检测和分析。结果44株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中,11株耐药菌经OprD2基因扩增呈阴性,扩增出IMP型阳性株4株,未检测到VIM型金属酶基因。认为北京天坛医院临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌,外膜蛋白OprD2缺失和产IMP型金属酶两种机制均起着重要作用。

布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并测序中国布鲁杆菌外膜蛋白基因OMP31和bp26,重组表达OMP31和bp26蛋白, 并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁杆菌基因组中获得OMP31和bp26基因,连接入PMD18-T克隆质粒并测序。测序后分别克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,在大肠埃希菌中表达融合蛋白。用Western-blot技术分析重组表达的GST-OMP31和GST-bp26的免疫学特性。结果 OMP31和bp26基因的测序结果与 GeneBank中已报道的布鲁杆菌株完全一致,并在大肠埃希菌中成功表达了GST-OMP31和GST-bp26融合蛋白。布鲁杆菌免疫兔血清能特异性识别所表达的蛋白而不与载体蛋白发生反应。结论成功表达了布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26,它可以被布鲁杆菌免疫血清特异性识别,表现出良好的抗原性,为之后的实验室诊断和亚单位疫苗的研究打下良好的物质基础。

幽门螺杆菌低分子质量外膜蛋白的基因克隆和重组载体构建

目的构建幽门螺杆菌26000u外膜蛋白的基因重组载体,为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础。方法用PCR方法从Hp染色体DNA基因组扩增26000u外膜蛋白的基因片段,将目的基因、pQE30质粒同时经BamHI、Hind Ⅲ双酶切、纯化、连接、转染以及筛选含插入片段的重组载体。结果经酶切、测序分析插入的基因片段为表达Hp26000u外膜蛋白基因,有1.1％碱基发生变异,以及1.51％氨基酸残基改变。与文献相比,其同源性高达98％。结论 Hp外膜蛋白基因克隆、重组载体的构建将有可能为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒的开发打下基础。

细菌外膜囊泡纳米载体的制备及其免疫调节作用

目的:以细菌外膜囊泡(OMV)结合三嵌段聚合物普朗尼克F127(PEO_(100)-PPO_(65)-PEO_(100)),构建能够有效促进巨噬细胞分泌抗肿瘤细胞因子的纳米载药体系OMV-F127。方法:培养减毒沙门菌,用超滤离心法与超声破碎法提取OMV,机械挤压法制得OMV-F127;蛋白质定量试剂盒和SDS-PAGE法检测OMV的蛋白含量和成分;荧光显微镜、透射电镜、动态光散射法检测OMV-F127形态学特征、粒径、电位及其稳定性;以小鼠巨噬细胞RAW246.7为细胞模型,ELISA检测OMV-F127对抗肿瘤细胞因子的分泌作用。结果:两种方法成功提取到减毒沙门菌的OMV,其蛋白质总量分别为2.8 mg/mL和2.7 mg/mL。成功制备OMV-F127且含有OMV的标志蛋白OmpF/C。OMV为纳米级囊泡结构,F127以及OMV-F127为球形纳米颗粒。OMV、F127、OMV-F127颗粒平均直径分别为(72±2)nm、(90±3)nm、(92±2)nm。OMV-F127能促进抗肿瘤细胞因子IL-12、α-TNF、γ干扰素的分泌。结论:基于细菌OMV的纳米载体OMV-F127能够有效促进巨噬细胞分泌抗肿瘤细胞因子,具有免疫调节作用。

感染过程中钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达水平变化及其调控机制

目的:了解感染人巨噬细胞过程中问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株主要外膜蛋白(OMP)抗原表达水平变化及其OmpR相关基因调控机制。方法:采用生物信息学技术预测问号钩体赖株OmpR及其组氨酸激酶(HK)基因和结构功能域。采用实时荧光定量RT-PCR检测钩体感染人THP-1巨噬细胞前后钩体主要OMP编码基因mRNA水平的变化。采用HK胞外区多肽抗血清封闭试验及氯氰碘柳胺阻断试验,检测OmpR及其HK对感染过程中问号钩体OMP编码基因mRNA水平变化的影响。结果:生物信息学分析结果显示,LB015和LB333可能是问号钩体赖株OmpR编码基因,LB014可能是其HK编码基因。问号钩体赖株感染THP-1细胞后,lipL21、lipL32、lipL41基因mRNA水平迅速并持续下降(P<0.01),groEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平瞬时迅速升高(P<0.01)。氯氰碘柳胺或HK抗血清处理可使感染THP-1细胞而显著下降的问号钩体lipL21和lipL48基因mRNA水平明显回升(P<0.01),氯氰碘柳胺处理可使感染THP-1细胞而显著升高的groEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平明显下降(P<0.01)。结论:问号钩体赖株感染人巨噬细胞后主要OMP抗原表达水平发生明显变化。问号钩体赖株染色体中存在一组编码OmpR及其HK的基因,其主要功能可能是下调感染过程中部分OMP抗原表达水平。

外膜蛋白与鲍曼不动杆菌多重耐药的相关性研究

目的分析外膜蛋白(OMP)与鲍曼不动杆菌多重耐药的相关性,更好地了解OMP在鲍曼不动杆菌多重耐药中的重要性。方法选取从重症监护病房(ICU)患者痰标本中分离的鲍曼不动杆菌50株,用Whonet5.4软件统计50株鲍曼不动杆菌对环丙沙星(CIP)和亚胺培南(IMP)的耐药情况,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析8株多重耐药鲍曼不动杆菌OMP表达情况,研究OMP的表达在鲍曼不动杆菌多重耐药中的重要性。结果 ICU患者分离出的鲍曼不动杆菌对CIP的耐药率达到88%,对IMP的耐药率达16%,耐药形势非常严峻;多重耐药的鲍曼不动杆菌均存在一种或多种OMP表达的下降或缺失。结论 OMP在鲍曼不动杆菌多重耐药中起着重要作用。

人苍白杆菌外膜蛋白的抗原性及其对羊布鲁菌交叉保护性的初步研究

目的对脑膜炎患者脑脊液中分离鉴定的人苍白杆菌进行外膜蛋白的抗原性及其对羊布鲁菌交叉保护性进行初步研究。方法以三氯醋酸法提取人苍白杆菌和羊布鲁菌外膜蛋白组分(OMP),并对小鼠进行免疫学试验。结果以羊布鲁菌OMP免疫和攻击后的10只小鼠,10 d内死亡4/10,脾脏检出菌3/10;而以人苍白杆菌OMP免疫的小鼠,在羊布鲁菌攻击后全部死亡,脾脏检出菌8/10。结论分离的人苍白杆菌OMP对羊布鲁菌并没有交叉保护作用,不能用作预防布鲁菌感染的候选疫苗抗原。至于人苍白杆菌的其他组分是否有效,有待于进一步分析探讨。

甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白质组学参考图谱的建立

目的建立甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白的蛋白质组学参考图谱。方法甲型副伤寒沙门菌CMCC 50973培养至对数生长末期,收集菌体并破碎提取细菌的外膜蛋白,然后利用双向电泳(2-DE)将蛋白分离。分离后取蛋白点做MALDI-TOF-MS鉴定,根据质谱得到的肽指纹图谱在Mascot数据库中查询出匹配的蛋白。结果在2-DE考马斯亮蓝染色凝胶上取77个蛋白点,鉴定成功了54个点,对应29种蛋白。29种蛋白中定位于外膜为13种,定位未知的有11种,胞质中有5种。结论成功建立了甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白的蛋白质组学参考图谱,为进一步筛选疫苗抗原打下了基础。

幽门螺杆菌OipA蛋白的研究进展

幽门螺杆菌（H.pylori）是人类重要的致病菌之一,近年其致病因子与胃肠疾病的关系已成为研究的热点,新的H.pylori致病因子逐渐被发现。外膜炎性蛋白A（OipA）是H.pylori外膜蛋白之一,研究发现OipA为H.pylori致病因子之一,与H.pylori相关疾病的发展密切相关,但不同地区研究结果不尽相同。本文旨在对H.pylori的致病因子OipA蛋白及其研究进展作一综述。

问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位

目的：改建问号钩端螺旋体（简称钩体）lipL21基因核苷酸序列以提高表达产量并了解基因改建前后表达产物免疫原性变化，确定外膜脂蛋白LipL21在钩体表面的定位。方法：参照大肠杆菌偏爱密码子设计，合成lipL21基因核苷酸序列并构建其原核表达系统。采用SDS—PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测改建前后lipL21基因表达量变化。采用钩体TR／PatocI抗血清为一抗的Westernblot鉴定改建前后两种目的重组蛋白rLipL2ls的免疫反应性，显微镜凝集试验（MAT）比较改建前后rLipL21s抗血清对不同钩体血清群的交叉免疫凝集效价变化。应用免疫电镜技术对LipL21进行定位。结果：改建前后lipL21基因表达量分别为细菌总蛋白的8．5％和46．5％。两种rLipL21均能与TR／PatocI抗血清发生免疫结合反应，免疫家兔后均能产生特异性抗体。两种rLipL21兔抗血清对我国15群15型钩体参考标准株MAT效价相近，均为1：80～1：320。LipL21位于钩体外膜表面。结论：LipL21是钩体表面抗原。改建后的lipL21基因可明显提高原核表达产量，其产物可保持良好的抗原性和免疫反应性，其抗体具有广泛的交叉免疫凝集活性。

细菌外膜蛋白BamA突变体构建及位点运动性分析

目的构建细菌外膜β桶状蛋白组装机器(BAM)核心组分BamA点突变原核表达载体,获得特定位点突变BamA蛋白,并分析该蛋白多肽易位相关(POTRA)结构域上G313位点运动特性。方法利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将BamA蛋白第690和700位天然半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S),将POTRA结构域上第313位氨基酸由甘氨酸(G)突为C,构建含BamA-C690S-C700S-G313C突变的原核表达载体pET22b-Strep-BamA。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导突变蛋白表达后,利用Strep-Tactin Sepharose柱亲和层析方法对突变体蛋白进行纯化。甲烷硫代磺酸(MTSL)标记所得纯化蛋白的半胱氨酸后,进行电子顺磁共振(EPR)波谱检测,通过EPR波谱拟合获得旋转相关时间τ_(c),分析G313C氨基酸位点的运动特性。结果构建了BamA-C690S-C700S-G313C突变体原核表达载体,实现了突变体蛋白有效表达和纯化。G313C位点EPR波谱为单成分运动状态波谱,其τc值为(2.30±0.03)ns。结论该研究建立了BamA点突变原核表达和蛋白纯化方法,并获得BamA蛋白G313C运动性特征参数,为进一步研究BamA蛋白在外膜蛋白整合过程中的结构机制提供了数据。

外排泵高表达和外膜蛋白缺失在铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药中的作用

目的探讨铜绿假单胞菌(PA)外科监护室(SICU)分离株对碳青霉烯的耐药机制。方法用W estern印迹和逆转录PCR测定外膜蛋白OprD、OprN表达水平和基因m exA的mRNA水平;用PCR扩增IMP、VIM金属酶基因和主动外排系统M exAB-OprM调控基因m exR,并测序。结果从SICU分离的49株PA,42株对碳青霉烯耐药,其OprD表达除PA42外均有不同程度的降低或缺失,而正常表达OprD的7株菌,均对2种碳青霉烯敏感。27株菌高表达主动外排系统M exAB-OprM,高表达组对亚胺培南耐药率81.5%(22/27)与低表达组耐药率86.4%(19/22)比较差异无统计学意义(χ2=0.005,P=0.943);而高表达组对美罗培南耐药率44.4%(12/27)与低表达组耐药率13.6%(3/22)比较差异有统计学意义(χ2=5.417,P=0.020)。14株表达了M exEF-OprN,但表达组对亚胺培南和美罗培南耐药率与未表达组耐药率比较差异均无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000)。8株高表达M exAB-OprM主动外排系统的调控基因m exR发生变异,其中7株出现氨基酸替换,1株提前出现终止密码子。未发现产IMP、VIM金属酶菌株。结论本院SICU分离的PA,对碳青霉烯耐药主要是由外膜蛋白OprD表达降低或缺失引起,与IMP、VIM金属酶无关;主动外排系统M exAB-OprM的高表达对美罗培南的耐药起重要作用;其高表达与调控基因m exR变异有关。

阴沟肠杆菌外膜蛋白缺失与头孢西丁耐药的关系

目的 了解阴沟肠杆菌外膜上的外膜蛋白与头孢西丁耐药的关系。方法 参照美国临床实验室标准化委员会M1 0 0 S9文件的确认试验测定超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs) ;超声破碎法提取ESBLs和外膜蛋白 (OMP) ,紫外分光光度法测定ESBLs活性 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析OMP的成分。结果 头孢西丁耐药的 9株阴沟肠杆菌菌株中 ,有 6株菌株缺少分子量为 1 80 0 0蛋白区带 ,不产生头孢西丁水解酶 ,其中有 5株产生ESBLs;2株菌株有 1 80 0 0蛋白区带 ,产生头孢西丁水解酶 ;1株菌株不缺少外膜蛋白 ,产生ESBLs,但不产生头孢西丁水解酶。对头孢西丁敏感的产ESBLs菌株 ,不产生头孢西丁水解酶 ,也不缺少外膜蛋白。结论 1 80 0

O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究

目的 研究经不同免疫途径 ,O1 5 7:H7大肠杆菌外膜蛋白 (OMP)对小鼠接受致死剂量该菌攻击后的免疫保护作用。方法 用外膜蛋白分别通过鼻腔、口腔和皮下途径对雌性BALB/c小鼠免疫 3次 ,采用ELISA测定血、阴道冲洗液和粪便内抗体水平 ;用Western 印迹方法分析诱导小鼠产生抗外膜蛋白特异性抗体的抗原 ;用致死剂量O1 5 7:H7大肠杆菌活菌经口腔攻毒 ,观察记录动物的发病与死亡情况 ;观察受染动物器官病理变化。结果 ELISA结果表明 ,经鼻腔与口腔免疫 ,能有效诱导抗外膜蛋白IgA和IgG免疫应答 ,鼻腔免疫更为有效。经皮下免疫仅能诱导血中产生高水平的特异性IgG抗体。攻毒后 ,鼻腔和口腔免疫组小鼠存活率明显高于对照组 (86 7%比 4 0 % ,P <0 0 1和 73 3%比 4 0 % ,P <0 0 5 ) ,鼻腔免疫组更高 (86 7%比 73 3% ,P <0 0 5 )。而皮下免疫组存活率甚至低于对照组 (1 3 3%比 4 0 % ,P <0 0 5 )。结论 O1 5 7:H7大肠杆菌外膜蛋白对实验小鼠的该菌株致死剂量攻击有较强的保护作用。鼻腔免疫途径为O1 5

淋病奈瑟菌外膜Porin I蛋白基因的构建、表达和鉴定

目的构建、克隆淋病奈瑟菌外膜PorinI(PI)蛋白基因,并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法克隆淋病奈瑟菌外膜PI蛋白基因,再与pGEX-4T-2载体连接成表达重组体pGEX-4T-2/PI;经大肠杆菌P2392表达后,用SDS-PAGE、切胶、电洗脱回收等方法纯化GST-PI融合蛋白;然后用特异性淋球菌外膜PI蛋白的单克隆抗体进行斑点免疫层析试验鉴定该蛋白。结果成功地获取了pGEX-4T-2/PI表达重组体,经诱导表达后能获得高表达的GST-PI融合蛋白,其相对分子质量为60000;斑点免疫层析试验显示其为淋病奈瑟菌外膜PI蛋白特异性的。结论本研究将有利于进一步研究淋病奈瑟菌外膜PI蛋白的功能。

76例耐亚胺培南铜绿假单胞菌B类碳青霉烯酶与耐药现状研究

目的调查耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药现状及其B类碳青霉烯酶和膜孔蛋白基因的存在情况,指导临床合理使用抗菌药物。方法连续收集2012年2月至2012年8月该院临床标本中分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌共76株,采用聚合酶链反应技术(PCR)检测耐亚胺培南铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶耐药基因及膜孔蛋白基因情况,并通过药物敏感试验了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征。结果 76株耐亚胺培南铜绿假单胞菌主要分布在神经外科ICU、神经内科ICU、烧伤科,分别占36.8%、25.0%、13.2%;所检菌株对多黏菌素B敏感,对其余9种抗菌药物均不同程度耐药;50株携带VIM基因,17株携带IMP基因,2株携带SIM基因,膜孔蛋白基因均未检出。结论耐亚胺培南铜绿假单胞菌多药耐药及泛耐药现象严重,其原因可能与多耐药基因表达及膜孔蛋白缺失有关,耐药基因以VIM、IMP为主,应加强耐药性监测,合理使用抗菌药物,防止耐亚胺培南铜绿假单胞菌的蔓延。