布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学方法的建立

目的建立布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,筛选布鲁氏菌保护性抗原。方法利用双向电泳技术对实验条件下培养的布鲁氏菌疫苗株M5外膜蛋白进行分离,结合WB(Western blotting)技术寻找发生免疫反应的蛋白质。结果21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后,代表了12个开放阅读框。这些蛋白不全是外膜蛋白,还存在胞浆蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域,还有一个功能未知的蛋白。结论成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路。

细菌外膜功能蛋白质组学的研究

病原菌严重危害人类健康、家畜家禽和水产养殖业。抗生素耐药性和疫苗保护谱等问题，使我们不得不面临卷土而来和日益严重的细菌性疾病的威胁。

羊布鲁氏菌外膜蛋白质的组成鉴定

目的:通过蛋白质组技术阐明羊布鲁氏菌外膜蛋白的主要组成。方法:提取并纯化羊布鲁氏菌的外膜蛋白,应用双向电泳技术进行分离,选取双向电泳图上主要的蛋白点进行质谱分析,同时主要蛋白质点的肽指纹图谱利用Mascot在NCBInr蛋白数据库中进行检索。结果:共鉴定到67个蛋白点,主要外膜蛋白为Omp25和Omp31,其他外膜蛋白如Imp、Frp、GroEL等,功能涉及物质运输、能量代谢、应激等。结论:对主要外膜蛋白Omp25和Omp31的识别与分析不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的研究,而且为布鲁氏菌病的疫苗研制提供靶标蛋白。

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

利用免疫蛋白质组学方法筛选高效的疫苗

厦门大学利用免疫蛋白质组学发展了一种快速筛选高效候选疫苗的方法。这种方法分为三个步骤：首先用免疫蛋白质组学方法筛选外膜蛋白的主要免疫原；接着，用毒性细菌在接种后激发以从免疫原中找出能够诱导中和性抗体产生的蛋白；最后，通过评估中和能力来筛选候选疫苗。通过质谱分析能够获得候选者的遗传信息以进行进一步的基因克隆。

再生蛋白质组学研究进展的力作——介绍《动物组织器官再生的比较蛋白组学研究》

由郑州大学出版社出版发行的《动物组织器官再生的比较蛋白质组学研究》一书是国家新闻出版广电总局“十三五”规划重点项目,获得国家出版基金资助。全书以大鼠肝再生以及分布于我国的蝾螈(Orientalis)断肢再生、三角涡虫(Japonica)头尾再生为研究对象,检测和分析了再生相关蛋白在动物组织器官中再生的生理、生化作用,包括细胞生长、细胞发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞的物质运输、细胞迁移、糖类代谢、脂类代谢、氨基酸代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、有机酸代谢、维生素、辅助因子代谢、激素代谢、一氧化碳代谢、生物氧化及活性氧代谢,论述了细胞内环境的稳定、对刺激的反应、免疫反应、凝血反应、炎症反应、自噬反应等,以及调节这些生理生化活动的信号通路活性。

铜绿假单胞菌外膜亚蛋白质组图谱的建立

铜绿假单胞菌是人类重要的病原菌,容易造成免疫缺陷患者如烧伤、艾滋病、癌症或囊性纤维化感染,对该菌外膜蛋白的研究有助于了解该菌的致病机制,为进一步疫苗研制奠定基础.采用月桂酰基氨酸钠的方法提取了铜绿假单胞菌的外膜蛋白,首次建立了外膜亚蛋白质组学表达图谱,鉴定了23个外膜蛋白,占所鉴定蛋白的82.1%.然后对其中的一个外膜蛋白基因PA3988进行了克隆及原核表达与纯化,经免疫小鼠获得抗血清后对外膜蛋白进行双向Westernblotting分析,验证了质谱的结果.这些研究结果对铜绿假单胞菌外膜蛋白的深入研究具有积极作用.

外膜蛋白疫苗对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的：研究幽门螺杆菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）外膜蛋白（ＯＭＰ）加大肠杆菌不耐热内毒素（ＬＴ）经口免疫对小鼠Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ感染的保护作用。探讨定量细菌培养在疫苗免疫效果评价中的应用。方法：从Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ ＮＣＴＣ１１６３７菌株制备ＯＭＰ和全菌超声粉碎抗原，ＬＴ作为粘膜免疫佐剂。通过灌胃分别以Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ全菌超声粉碎抗原１ｍｇ加ＬＴ １０μｇ（Ａ组）、Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ ＯＭＰ ０．５ ｍｇ加ＬＴ １０μｇ（Ｂ组）和生理盐水（Ｃ组）免疫小鼠（ｎ＝３０），每周１次，共４次。免疫完成后４周以Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ Ｓｙｄｎｅｙ Ｓｔｒａｉｎ１菌株攻击小鼠１次（１×１０７ ＣＦＵ／只），攻击后４周处死小鼠，取胃分别作快速尿素酶试验、病理检查及定量细菌培养，观察Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ定植情况。结果： Ｃ组小鼠Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ定植密度为２．４０×１０７ＣＦＵ／ｇ胃组织，Ａ组和Ｂ组小鼠分别为２．０３×１０５ ＣＦＵ／ｇ和６．７６×１０５ＣＦＵ／ｇ胃组织，免疫组的定植密度明显降低。结论：口服Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ ＯＭＰ加ＬＴ对小鼠Ｈ． Ｐｙｌｏｒｉ感染具有一定免疫保护作用，但不能完全预防感染，需进一步筛选更为有效的抗原和佐剂。定量细菌培养可以?

重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的建立

目的建立以重组外膜蛋白为基础的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。方法以基因重组技术获取重组钩端螺旋体外膜蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA方阵滴定、交叉性试验、阻断试验,并对北京地区的70份犬血清使用建立的ELISA方法以及德国Virion公司的全菌体钩端螺旋体ELISA试剂盒进行相互验证。结果方阵滴定试验确立以100ng/孔为抗原包被浓度,1∶160为血清稀释度。交叉性试验具有广泛性、阻断试验标明该方法特异性强、灵敏度高。两种方法数据经χ2检验,两者检出率之间差异不显著。结论重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。

百日咳杆菌外膜蛋白免疫保护作用及其机理的研究

经戊二醛脱毒前或后的百日咳杆菌外膜蛋白免疫的ＮＩＨ小鼠，其ＰＤ５０分别为９８．１０～１０９．００和６９．３５～７７．０６μｇ／ｋｇ，但其ＬＤ５０分别为３７．９０～４２．１１和１０７．２０～１１９．１１ｍｇ／ｋｇ。脱毒后的百日咳杆菌外膜蛋白１次免疫小鼠的保护率 为７５．０％，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和Ｔ淋巴细胞转化率明显上升，免疫后第６０ｄ 血清抗体效价达到高峰，以后逐渐下降，抗体类型以ＩｇＭ为主。经脱毒外膜蛋白２次免疫的小鼠保护率高达９５．８％．小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、Ｔ和Ｂ淋巴细胞转化能力均显著增强，免疫后第１８０ｄ仍能测出较高效价的血清抗体，抗体类型转为以ＩｇＧ为主。实验结果证实，脱毒后的百日咳杆菌外膜蛋白能安全有效地刺激机体产生特异性免疫力，且２次免疫的效果优于１次免疫。

细菌外膜囊泡纳米载体的制备及其免疫调节作用

目的:以细菌外膜囊泡(OMV)结合三嵌段聚合物普朗尼克F127(PEO_(100)-PPO_(65)-PEO_(100)),构建能够有效促进巨噬细胞分泌抗肿瘤细胞因子的纳米载药体系OMV-F127。方法:培养减毒沙门菌,用超滤离心法与超声破碎法提取OMV,机械挤压法制得OMV-F127;蛋白质定量试剂盒和SDS-PAGE法检测OMV的蛋白含量和成分;荧光显微镜、透射电镜、动态光散射法检测OMV-F127形态学特征、粒径、电位及其稳定性;以小鼠巨噬细胞RAW246.7为细胞模型,ELISA检测OMV-F127对抗肿瘤细胞因子的分泌作用。结果:两种方法成功提取到减毒沙门菌的OMV,其蛋白质总量分别为2.8 mg/mL和2.7 mg/mL。成功制备OMV-F127且含有OMV的标志蛋白OmpF/C。OMV为纳米级囊泡结构,F127以及OMV-F127为球形纳米颗粒。OMV、F127、OMV-F127颗粒平均直径分别为(72±2)nm、(90±3)nm、(92±2)nm。OMV-F127能促进抗肿瘤细胞因子IL-12、α-TNF、γ干扰素的分泌。结论:基于细菌OMV的纳米载体OMV-F127能够有效促进巨噬细胞分泌抗肿瘤细胞因子,具有免疫调节作用。

中耳细菌感染诱导的急性期HSP-70相关反应的免疫组织化学研究

探讨中耳细菌感染急性期时 ,哺乳动物中、内耳热休克反应的部位 ,以及中耳细菌感染诱生的热休克蛋白是否可能引发内耳自身免疫损伤。运用中耳注射肺炎克雷伯杆菌制成豚鼠中耳急性感染动物模型 ,分别于接种后第 1、3、5、7天处死动物取材。应用免疫组化技术 ,研究了中耳粘膜和耳蜗表达热休克蛋白 70 (HSP- 70 )的部位。结果表明 :正常状态下 ,中耳粘膜表层的上皮细胞和内耳膜迷路血管纹、螺旋韧带、Corti氏器均有弱的阳性反应 ,感染应激后 ,上述同样部位均有强的阳性显色。不同取材时段显示的阳性位置无差异。说明在中耳急性细菌感染期 ,中耳粘膜和内耳组织均表达了同源 HSP- 70蛋白分子 ,这些同源 HSP- 70为引发内耳自身免疫损伤提供了物质基础。

从免疫学角度看麻风分类

人们都说麻风的病型是根据受感染者的个体免疫程度来分的,但决定病型的却主要是依靠病理学的所见。即使现在免疫学已有了很大的进步,要据以说明麻风的病型还是相当困难的。麻风专家们都知道有易患麻风的人和不易患麻风的人,其原因何在,目前还不清楚。当进行麻风研究时,对其免疫与发病的关系这样一个复杂的问题,没有某种统一的理论,便会自相矛盾,走向错误的方向,或者发生意想不到的曲折。将麻风分为LLp、LLsp、BL、BB、BT、TTsp和TTp时,LLp就是在胎儿期从母亲那儿感染了麻风菌,带着麻风菌长大起来的人对麻风菌就变得有完全的耐受性了。

结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究

目的对结核分枝杆菌相对分子质量为38000（以下采用38kD表示）、线粒体通透性转换蛋白64（mitochondrial permeability transition64，MPT-64）和肝素结合血凝素（heparin-binding haemaggIutinin，HBHA）蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较，并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估。方法选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核（ATB）组，共78例；选取同期36例潜伏结核感染（LTBI）患者作为LTBI组；同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群（HC）作为HC组。将本实验室前期纯化的38kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中三种蛋白抗体的表达水平，经过统计学处理后，分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异，并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度，评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值。结果ELISA检测ATB组38kD蛋白抗体的吸光度（A）450cm处的A值（0．343±0．120）高于LTBI组（0．221±0．102）和HC组（0．143±0．097），差异有统计学意义（t=3．07，P〈0．05）；MPT64抗体的A450值（0．234±0．102）高于LTBI组（0．198±0．087）和HC组（0．123±0．075），差异有统计学意义（t=3．79，P〈0．05）；HBHA抗体的A450值（0．263±0．113）高于LTBI组（0．188±0．091）和HC组（0．148±0．078），差异有统计学意义（t=2．70，P〈0．05）。以38kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分别为0．78、0．61和0．62，敏感度分别为71．79％、62．82％和52．56％，特异度为72．22％、58．33％和69．44％；从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0．91、0．81和0．79，敏感度分别为87．17％、69．23％和73．08％，特异度为80．65％、74．19％和74．19％；从HC组鉴别LTBI组AUC分别为0.63、0．75和0．69，敏感度分别为58．33％、77．78％和63．89％，特异度为64．52％、51．61％和74．19％。结论MTB38kD、MPT64和HBHA蛋白都有较好的免疫反应性，3种蛋白抗体在不同患者人群血清中的表达水平有差异，对肺结核诊断价值的评估结果表明采用ELISA对外周血中MTB蛋白抗体进行检测可作为结核病临床检测诊断的辅助方法。

结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究

目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核抗体。结果 rMtb81蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,相对分子量约80.7kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rMtb81抗体的阳性率分别为37.9%和41.1%,总的灵敏度为39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗Mtb81抗体的阳性率分别为1.1%和6.2%。结论 rMtb81蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

外膜蛋白OprD2缺失和金属酶产生在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中的作用

采用K-B法测定10种抗菌药物对44株铜绿假单胞菌的体外抗菌活性,使用双纸片协同试验进行金属酶筛选,用PCR方法对耐药基因OprD2、IMP和VIM基因进行检测和分析。结果44株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中,11株耐药菌经OprD2基因扩增呈阴性,扩增出IMP型阳性株4株,未检测到VIM型金属酶基因。认为北京天坛医院临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌,外膜蛋白OprD2缺失和产IMP型金属酶两种机制均起着重要作用。

基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损及相关免疫学研究

目的观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损效果及异种骨支架体内应用的安全性。方法①制备去抗原牛松质骨块(BCB),植入小鼠股四头肌袋内,术后行淋巴细胞转化试验和组织学观察。②在腺病毒载体介导下将BMP-2基因导入兔骨髓间质干细胞后,种植到BCB支架中,构建基因修饰的组织工程骨。于兔双侧桡骨中段造成15mm骨缺损,采用5种方法进行处理BMP-2基因转染细胞+BCB(A组);未转染细胞+重组BMP-2+BCB(B组);对照基因转染细胞+BCB(C组);未转染细胞+BCB(D组);单纯BCB(E组)。术后4、8、12周行X线、组织学和生物力学检测。结果①BCB具有较低的抗原性和良好的组织相容性;②A组术后4周诱导生成软骨组织并向编织骨转化,12周骨缺损修复,髓腔再通,新骨强度明显优于其他各组(P<0.01)。结论BMP-2基因修饰的组织工程骨是修复节段性骨缺损的好方法。

嗜水气单胞菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究

目的建立嗜水气单胞菌ATCC7966外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法。方法利用双向电泳技术对嗜水气单胞菌外膜蛋白进行分离，用LC-LTQ-XL质谱技术鉴定，并结合Westernblot技术寻找具有免疫应答的蛋白质。结果LC-LTQ-XL质谱共鉴定出43个肽段，共计39个蛋白质。这些蛋白质不仅有外膜蛋白（69％），还有内膜蛋白（12％）等，功能涉及物质运输、细胞运动和生物合成等领域。最终利用2D结合Westernblot技术找到了一个疫苗候选蛋白。结论成功建立了嗜水气单胞菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法，为将来发现更多候选疫苗提供理论基础。

衔接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9与抗结核免疫的相关性

结核病是一种慢性传染病,全球每年有170万例患者死于结核病。我国结核病患者例数居世界第二位,也是耐药结核病流行严重的国家之一,因结核病死亡的人数超过其他传染病死亡人数的总和。因此,研制有效的抗结核药物和新型疫苗迫在眉睫。这需要对宿主与Mtb相互作用机制、抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)内部信号传导机制及其关键分子进行深入理解。宿主感染Mtb后,通过模式识别受体(pattern recognitionreceptors,PRRs)识别Mtb表面病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并将信号传递给衔接分子,后者启动下游的信号级联反应,诱导固有免疫细胞合成细胞因子,活化宿主免疫机制。本综述对一种重要的衔接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9,CARD9)及其与抗结核免疫的相关性进行简要阐述,为结核病的治疗和疫苗的研制提供参考。

54例轻链型单克隆免疫球蛋白血症的蛋白水平分析

目的研究分析54例轻链型单克隆免疫球蛋白血症的体液蛋白特征。方法利用免疫固定技术从2 765例单克隆免疫球蛋白血症中筛查出275例轻链型患者,对其中54例患者进行血清蛋白电泳、尿液本-周蛋白、尿液蛋白定性、尿液蛋白定量以及尿液中轻链含量等检测。结果 54例轻链型单克隆免疫球蛋白血症中,属κ轻链型的有24例,占44%,尿液中κ轻链含量为(1.86±1.77)g/L,κ/λ值为(277.22±253.56);属λ轻链型的有30例,占56%,尿液中λ轻链含量为(0.70±0.58)g/L,κ/λ值为(0.03±0.02);54例患者血清蛋白电泳中仅有12例在α2～γ区间有淡染的M带出现;患者的尿液均呈本-周蛋白阳性,其中30例尿蛋白定性呈阴性或弱阳性,其余24例尿蛋白定性呈+～2+,尿蛋白定量为0.2～8.6g/L之间。结论轻链型单克隆免疫球蛋白血症患者血清蛋白电泳结果的M蛋白检出率低,尿液中蛋白多为低浓度,因此利用高灵敏度的免疫固定技术检测患者的血清及尿液中的游离轻链,能够提高该病患者M蛋白的检出率。