基于细菌展示技术的高通量抗原表位筛选方法的建立

目的：本研究旨在利用细菌表面展示技术结合流式细胞术建立一种快速直观的抗原表位的新方法。方法：本研究以传染性法氏囊病毒结构蛋白VP2作为目标蛋白，对该方法的可行性进行检测。将VP2基因分为连续不重叠的5个基因片段（V1～V5）。将各段基因分别克隆至细菌展示载体pAPEx中．转化大肠杆菌DH5a，利用IPTG诱导使蛋白片段锚定表达于大肠杆菌细胞间质侧的内膜上，利用溶菌酶破除细菌外膜（原生质球制备），使蛋白片段暴露于原生质球表面。将该原生质球先后与传染性法氏囊病毒多克隆抗体和FITC标记的兔抗鸡抗体进行孵育，利用流式细胞仪（Flowcytometer，FC）检测原生质球的荧光信号强度。结果：FC结果显示，除V2片段外其余片段均有很强的荧光信号，其荧光强度为V3最强，Vl、V4、V5其次。该结果说明V1、V3、V4、V5段存在抗原表位，V2段中无表位。为验证Fc结果，本研究利用传统方法对各基因片段进行表达、纯化及Westernblot鉴定，结果显示V3与多抗的结合能力最强，v2段无阳性反应，与FC结果相符。此外，本研究利用抗原表位分析软件对各蛋白片段潜在抗原表位进行预测，其结果与FC结果相一致。结论：本研究利用Fc对抗原表位筛选过程进行实时监测，通过荧光信号强弱即可判断抗原表位是否存在及强弱，与传统抗原表位筛选方法相比，节省了时间提高了效率。利用该方法可以快速地筛选出优势表位，对于流行病病原的基础研究及疫苗的研制具有重意义。

利用细菌表面展示技术强化细胞固定化生产吲哚-3-乙酸

目的利用细菌表面展示技术,以冰晶核蛋白INaA、INaK为锚定蛋白,将负电荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)锚定在大肠杆菌表面(Escherichia coli),增加细胞膜表面携带的负电荷,与改性后带正电荷的生物炭吸附以强化生物炭固定化细胞的功能。利用2 mol·L^(-1)的FeCl_(3)改性玉米秸秆生物炭使其呈正电性,将改性生物炭与细胞表面负电荷增加的重组菌株进行静电吸附,重组菌株EPA03与对照菌株相比吸附率提高31.75%。将此策略应用在固定化细胞高效生产IAA的菌株中,在全细胞催化连续循环中,菌株EPA03连续循环中能连续反应6个循环,IAA积累量比对照菌株提高了42.85%。

错配PCR技术提高抗hIL17A单链抗体亲和力的研究

目的:通过错配PCR技术提高1株人源化抗hIL17A单链抗体(scFv)的亲和力,为进一步开发治疗类风湿性关节炎(RA)的人源化抗体药物奠定基础。方法:本研究采用错配PCR和重叠PCR的方法,对抗体的重链、轻链可变区分别随机引入突变,并将细菌内膜展示技术和流式细胞技术(FCM)相结合进行高通量筛选,获得高亲和力突变株。由于hIL17A能刺激HeLa细胞产生白细胞介素IL-6和IL-8,因此scFv突变株经表达纯化后,利用real-time PCR技术在mRNA转录水平上检测其阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力。结果:筛选出5株突变株,经流式细胞仪检测其中有3株亲和力与亲本相比有很大程度的提高,2株与亲本相当,而且所有突变株均保留了亲本与hIL17A的结合能力,经real-time PCR检测证明这5株突变株均有阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力,突变株的亲和力与中和效果成正比。结论:错配PCR技术是抗体体外亲和力提高的一种可行性方法,在保证与抗原结合能力的基础上提高了其亲和力和中和活性。该实验结果为RA的靶向治疗提供了候选药物,而且也为抗体的体外亲和力的提高提供了参考方法。