水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR快速检测鉴定

成功建立了水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。根据含铁细胞接受子基因设计两菌的通用引物PSRGF PSRGR(扩增一个 1 5 2bpDNA片段 )和特异性探针 (Baiprobe和Tiaoprobe) ,并对 1 3种细菌和 1种植原体进行实时荧光PCR。结果表明 ,两个特异性探针能分别特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其它参考菌不产生荧光信号。检测的绝对灵敏度是 3 0 .6fg μL质粒DNA和 1 0 3CFU mL的菌悬浮液 ,相当于 1个细菌细胞的基因 ,比常规PCR电泳检测高约 1 0 0倍 ,相对灵敏度为 1 0 5CFU mL。整个检测过程只需 2h ,完全闭管 ,降低了污染的机会 ,无需PCR后处理。用这两个特异性探针分别对自然感染白叶枯菌和条斑菌的叶片DNA提取液和种子浸泡液进行实时荧光PCR ,结果均可特异性检测到目标菌的存在并完全可将两种病原细菌区分开来 ,且只需 0 3g叶片和 1

中南4省水稻细菌性条斑病菌致病型的比较

以金刚 30、窄叶青、XM 5、XM 6、M4 1等 5个品种为鉴别品种 ,将来自 4省的 75个细条病菌菌株的毒力划分为 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等 7个致病型 ,0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型毒力差异主要呈由弱到强的数量变化 ,占测试株的 89.3% ,其中较强毒力的Ⅲ、Ⅳ型菌占参试菌的 5 4 .7% ;Ⅴ和Ⅵ型间呈交叉反应式的强互作关系 ,占参试菌的 10 .7%。 4省菌株毒力的比较表明 ,福建省以Ⅲ、Ⅳ型菌为主 ;江西省以Ⅲ、Ⅵ型菌为主 ;湖北省以Ⅱ、Ⅲ型菌为主 ;湖南省没表现突出的优势群 ,但较强毒力的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型菌所占比例为 5 5 .6 %。

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。

水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究

从江苏省南京、泰州、扬州和宿迁等地区水稻田采集水稻病叶、健叶、根围土等样品90份,分离纯化得到1173个细菌分离物,对其进行水稻细菌性条斑病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzicola皿内抑制试验,共获得12株拮抗能力较强的细菌,其中4株拮抗细菌抑菌圈直径大于27mm。盆栽试验结果表明,12株拮抗能力较强的细菌中有4株对水稻细菌性条斑病菌防效大于50%,其中菌株Lx-11盆栽防效达62.5%。大面积示范试验结果表明菌株Lx-11田间防效达60.2%,显著高于化学药剂20%叶枯唑的防效(51.2%和45.8%)。形态特征、理化特性和分子鉴定分析确定菌株Lx-11为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

西南地区水稻细菌性条斑病菌致病力的分化

以水稻品种IRBB4、IRBB5、IRBB14、IRBB18、IRBB21和IR24为鉴别品种,在孕穗期,采用针刺接种的方法,将水稻条斑病菌接种在水稻剑叶上,根据病菌与品种互作反应和亲和性的类型差异,将供试的75株条斑病菌菌株区分为13个小种群.大多数水稻条斑病菌株在鉴别品种上的互作反应表现为弱互作模式.云南、贵州、四川3省菌株小种组成的比较表明:以小种C9为目前3省的共同优势种群;云南省小种组成多样,所有的小种均有分布,贵州小种类型有6、9、11、13,四川小种类型有3、4、6、7、9、11、12、13,小种的分布受地理区域的影响.

水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR检测技术研究

水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329 bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25 fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10 g的带菌种子上目标菌的存在。

西南地区水稻细菌性条斑病菌的遗传多样性分析

选取云南、贵州、四川不同省市地区的水稻条斑病菌菌株141株,利用Rep-PCR技术筛选出多态性较好的引物对其DNA进行多态性分析。引物J3、ERIC、JELIR的扩增多态性较好,不同毒性菌株间的Rep-PCR指纹图谱差异很大。通过聚类分析显示,我国西南地区的水稻细菌性条斑病菌群体遗传分化明显,菌株的遗传族群与其致病性具有一定的相关性,强、中、弱毒性菌株大致归为不同的类群。因此,Rep-PCR技术可用于检测水稻细菌性条斑病菌的遗传变异与鉴定研究。

水稻细菌性条斑病菌致病型鉴别品种的筛选

以针刺接种法研究了 2 0个水稻品种与 4 0株稻细条病菌的互作关系 ,并通过对品种抗感性和生育性的比较 ,选出金刚 30、窄叶青、XM5、XM 6、M 4 1作为鉴别品种 ,将 4 0株稻细条病菌划分成 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等 7个型 ,各型的反应模式依次为 :RRRRR、SRRRR、SSRRR、SSSRR、SSSSR、SSRSR、SRSRRR ;在湖北种植条件下 ,此套鉴别品种可以鉴别出病菌毒力呈强弱性反应的数量变化和呈互作交叉性反应的质量变化。

广东水稻细菌性条斑病菌致病性分化研究

水稻抗病性是寄主与病原物互作的结果,病原菌系的分化研究是抗病资源筛选及抗病育种的前提。研究以水稻品种金刚30、IR24、IRBB21、IRBB14、IRBB5、IRBB4、五山丝苗等为鉴别品种,对来自广东地区72个细菌性条斑病菌菌株进行致病力分化测试,并开展了部分广东主栽品种对广东细菌性条斑病菌优势菌系抗性鉴定。结果表明,广东地区的细菌性条斑病菌菌株致病力分化明显,测试菌株可分为19个致病型,其中优势致病型为C18(SSSSRSS)和C5(SRRRRRS),分别占25%、23.61%;强致病性菌系菌株C17(SSSRSSS)、C18(SSSSRSS)、C19(SSSSSSS)占测试菌株的27.78%,主要分布在广州、惠州、阳春、茂名、新会、广宁、雷州地区。测试18个广东主栽品种中,除新银占对测试的优势菌系C18(SSSSRSS)表现中感,其余的均表现感病。

西南地区水稻细菌性条斑病菌链霉素抗性研究

为明确西南地区水稻细菌性条斑病菌链霉素抗性情况、建立链霉素敏感基线、筛选抗性突变菌株,本研究采用离体法检测了云南、贵州和四川三地条斑病菌株对链霉素的敏感性,利用紫外诱变、药剂驯服的方法诱导抗链霉素突变菌株并检测其突变位点.结果显示：不同地理来源的菌株对链霉素的敏感性存在一定差异;三地菌株的链霉素EC5o值范围是0.165 ～1.532 μg/mL,将其均值0.667 μg/mL作为西南地区水稻细菌性条斑病菌对链霉素的敏感基线;紫外诱变获得对链霉素抗性最高的突变菌株30-U-3,其EC50值为57.544 μg/mL,抗性倍数达138.661倍;链霉素抗性基因（rpsL基因）中第43位氨基酸由赖氨酸（AAG）突变为精氨酸（AGG）.可见,西南地区目前虽无抗链霉素的自然突变菌株,但云南楚雄已发现抗性较高的菌株,应该采取积极的抗药性治理措施.

辣椒疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)和水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)的质粒及其与耐链霉素和耐铜性关系

从不同省份收集到辣椒疮痂病菌Xanthomonasvesicatoria(XV) 7个菌株和水稻细菌性条斑病菌X .oryzaepv .oryzicola(XOZ) 14个菌株 ,进行了质粒微量制备。XV菌株除XV1外都检测到质粒 ,单个菌株拥有的质粒数为 2～ 5个 ,大小在 10～ 10 0kb,没有发现为所有菌株所共有的质粒 ,但XV2、XV3、XV4、XV5、XV6共享 1个大约 5 5kb的质粒。 14个XOZ菌株都含有 1个质粒 ,除XOZ5外 ,其余的 13个菌株都含 1个约 4 0kb的质粒。所有菌株都不耐铜。XOZ菌株仅XOZ7对链霉素表现耐性 ,4个XV菌株即XV4、XV5、XV6和XV7耐链霉素。用XV质粒转化无质粒菌株 ,发现XV5的 1个 76Kb质粒与耐链霉素有关。

水稻细菌性条斑病菌DNA多态性与致病性研究

利用 6 0个随机引物对来自我国不同稻区的水稻细菌性条斑病菌株基因组DNA进行PCR扩增 ,其中2 0个引物均出现清晰和重复性的DNA扩增片段 ,扩增片段大小在 0 .5kb至 3.5kb ;应用Statistics软件UPGMA程序进行树状聚类分析 ,聚类结果表明 ,我国水稻细菌性条斑病菌具有明显的遗传分化 ,在遗传距离为 0 .30时 ,供试菌株可划分为 7个遗传相似组 (谱系 )。其中第 1、第 2和第 5组为优势组群 ,分别由 7、8、6个菌株组成。根据菌株在 12个已知基因品种上的抗感反应 ,将供试菌株分为 13个致病型 ,在遗传距离为 0 .5 0水平上聚类归属于 6个簇。

水稻细菌性条斑病菌抑菌植物筛选及杀菌剂活性测定

采用带药平板涂布法测定了32种植物甲醇提取物、1种植物精油和13种杀菌剂对水稻细菌性条斑病菌的抑菌活性。结果表明,在植物甲醇提取物中,杠板归、老虎刺、广东蛇葡萄、细叶桉、枫杨提取物的MIC值分别为4 000、6 000、6 000、10 000、10 000 mg/L;其余植物提取物的MIC值>10 000 mg/L。在13种杀菌剂中,64%杀毒矾可湿性粉剂,3%中生菌素可湿性粉剂,58%甲霜.锰锌可湿性粉剂和2%加收米可溶液剂抑菌活性较高,MIC值分别为12.8、15、48.3、80 mg/L;其次为53.8%可杀得水分散粒剂和20%叶枯唑可湿性粉剂,MIC值分别为134.5、400 mg/L;其余杀菌剂的活性较低,20%噻唑锌悬浮剂和72%农用链霉素可溶粉剂的MIC值分别为2 000、4 311.4 mg/L,50%敌克松可湿性粉剂、80%代森锰锌可湿性粉剂、60%甲硫.异菌脲可湿性粉剂、15%三唑酮可湿性粉剂和75%百菌清可湿性粉剂5种药剂在稀释100倍时对水稻细菌性条斑病菌无抑菌活性。

水稻细菌性条斑病菌单克隆抗体的制备及特性

用7株水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas campestris pv.oryzicola）分别免疫BALB/C小白鼠。建立了15株分泌抗水稻细菌性条斑病菌特异性抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株的细胞染色体数范围为98—104。酶联免疫吸附试验（ELISA）培养液中的抗体滴度为102—103,腹水中抗体滴度105—106。这些单克隆抗体（McAb）的免疫球蛋白亚类分别属于IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM。McAb与水稻细菌性条斑病菌发生特异性反应;与水稻白叶枯病菌（X.c.pv.oryzea）等黄单胞杆菌属的其它变种菌株无交叉反应;与植物病原细菌其它4个属的测定菌株无交叉反应;与稻叶、稻种上分离的杂菌也无交叉反应。

一种高效分离水稻细菌性条斑病菌的新方法

[目的]介绍一种将常规方法改进成为一种适用于分离存放时间过久的细条病样本的新方法。[方法]用注射器渗压法将病害标本的研磨液接种水稻叶片形成新鲜病斑后,再按改进的常规方法进行分离纯化。[结果]该新方法分离纯化可直接得到单菌落。[结论]该方法是一种适用于分离存放时间过长的水稻细菌性斑条病菌标本的方法。

西南地区水稻细菌性条斑病菌对申嗪霉素及噻唑锌敏感基线的建立

从西南地区云贵川3省分离得到水稻细菌性条斑病菌菌株43株,离体条件下检测菌株对申嗪霉素及噻唑锌的敏感性.结果表明：不同地理来源的菌株对两种药剂的敏感性均存在一定差异.噻唑锌及申嗪霉素对各地来源菌株的EC5o值的分布范围分别是0.439 ～2.549 μg·mL-1和0.035～ 1.598 μg·mL-1,平均值分别为1.641、0.868 μg·mL-1.初步确定将四川、贵州、云南3省菌株的EC50平均值1.641、0.868 μg· mL-1分别作为西南地区水稻细菌性条斑病菌对噻唑锌及申嗪霉素的敏感基线.

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。

水稻细菌性条斑病菌一个新基因与致病相关

水稻细菌性条斑病菌是水稻的主要病原菌之一,其引发的水稻细菌性条斑病可造成水稻严重减产。利用广西分离株GX01作为建库出发菌株,采用EZ::Tn5转座子标签法构建GX01菌株的Tn5随机插入突变体库,其后利用针刺接种法在水稻上进行致病性试验,筛选到1个致病性明显下降的突变体。TAIL-PCR定位该突变位点位于XOC3376,该基因的编码产物注释为假设蛋白。为了研究XOC3376的功能,对其进行表型检测及功能互补,结果表明其互补菌株的表型及致病力都能恢复到野生型的水平。本文为进一步研究水稻细菌性条斑病菌的致病相关基因的功能、阐明该病菌的致病机理奠定基础。

水稻细菌性条斑病菌的血清学特异性

从水稻细菌性条斑病菌的细胞中抽提出两大类抗原物质。一类是黄色的蛋白质，其中某些抗原成分为水稻白叶枯病菌和５个野油菜黄单胞菌致病变种的共同抗原，是非特异的；另一类是白色的蛋白质，是特异的，其相对应的抗血清在琼脂双扩散试验中，与来自不同省、区的水稻细菌性条斑病菌稳定地形成２条清晰的沉淀带，而与水稻白叶枯病菌和５个野油菜黄单胞菌致病变种不起反应。

水稻细菌性条斑病菌单克隆抗体的分类及其单抗血清型研究

用水稻细菌性条斑病菌（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＰＶ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交融合，建立了５株分泌抗水稻细菌性条斑病菌的特异性，有鉴别力的杂交瘤细胞株：Ｍ＿（２３）、Ｍ＿６、Ｍ＿（１７）、Ｍ＿（２６０）、Ｍ＿（２９）。这５株单抗分别与来自不同区域的１２８株水稻细菌性条斑病菌进行酶联免疫吸附试验，结果表明：可将这些菌株识别出５个抗原决定簇，区分出７个单抗血清型（ＭＣＡｂＩ一Ⅶ）据此我们认为以单抗作为病菌分类的依据是可行的。