Ag43/GFP嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达

目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒p EGFP-C1切取GFP基因序列,首先将Ag43'基因序列插入表达质粒p ET-22b中,获得重组质粒p ETAg43',然后再将GFP基因序列插入p ETAg43'获得质粒p ETAg43'/GFP。将重组质粒p ETAg43'/GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109(△Ag43),用荧光显微镜和SDS-PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43'/GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43'和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒p ETAg43'/GFP经诱导后可以将Ag43'/GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109(△Ag43)的表面,55℃加热50 min是提取Ag43'/GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43'/GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。

大肠埃希菌JM109表面抗原Ag43基因敲除与鉴定

目的敲除大肠埃希菌JM109表面抗原43(Ag43)基因并对其进行鉴定。方法采用Sigma公司的TargeTron基因敲除系统和Ag43基因特异设计的PCR引物扩增获得突变Ⅱ组内含子RNA蛋白复合体(RNP)基因序列,然后将这段基因序插入表达RNP的质粒pACD4K-C中,获得Ag43特异的重组RNP质粒pACD4K-Ag43。最后将pACD4K-Ag43转化JM109,经过IPTG诱导表达将Ⅱ组内含子插入Ag43特异的部位。结果通过软件分析发现插入Ⅱ组内含子的最佳位点位于碱基1 812和1 913之间,琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的突变Ⅱ组内含子RNP基因序列分子量大小和预期值(350bp)相一致,用NheⅠ和HindⅢ二种酶切分析重组质粒pACD4K-Ag43结果和预期值相符,PCR扩增相应产物和基因测序显示Ⅱ组内含子特异地插入Ag43基因碱基序列的1 812/1 913位点。结论成功地将大肠埃希菌JM109中的基因敲除,为更进一步深入研究Ag43基因的功能和将其作为制备重组Ag43嵌合蛋白的宿主菌奠定了基础。