人细菌透性增加蛋白cDNA的克隆及序列分析

从新疆维吾尔族健康人造血干细胞中提取总RNA,用反转录(reverse transcription,RT)和降落PCR (touchdown PCR,TD-PCR)相结合的方法扩增人细菌透性增加蛋白(human bactericidal/permeability-increasing protein,hBPI)的cDNA,将其克隆到pEGFP-N1载体上并进行DNA序列测定。结果表明,所克隆的hBPIcDNA全长为1,464个碱基,其序列与GenBank中另外4个序列进行了比对,有两个碱基与其它4个序列不同:其中第576位碱基其它序列为G,该位置碱基是C;第676位碱基其它序列为A,该位置碱基是G。其中第676位碱基的变化导致第185位氨基酸由Lys改变为Glu。

天然抗感染分子-细菌透性增加蛋白

革兰氏阴性菌细胞外壁中的脂多糖结构即内毒素,经常是引发脓毒症、菌血症等系统性炎症反应的“元凶”。近十余年的研究发现,细菌透性增加蛋白(bactericidal／permeability-increasing protein,BPI)具有特有的中和内毒素和拮抗革兰氏阴性菌的能力,是一种抗感染的天然的分子靶。大量的临床研究结果已经显示其用药的有效性和安全性。近几年来国外生物药业公司正努力将重组人BPI推向市场。

hBPI与EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在MCF-7细胞中的表达和定位

目的:探讨人细菌透性增加蛋白(hBPI)在哺乳细胞中的表达和亚细胞定位。方法:以本人克隆得到的质粒pBE1为模板,利用一对带有Kozak序列以及删除终止密码子的引物进行PCR,获得的产物与pEGFP-N1载体连接,构建pBE2哺乳细胞特异表达载体并稳定转染MCF-7细胞,获得了转基因细胞系。提取其基因组DNA,PCR扩增检查BPIcDNA片段和EGFP片段是否已整合入MCF-7细胞基因组中。提取总RNA,通过RT-PCR方法检查BPI-EGFP在转录水平的表达。Western blot进一步鉴定融合蛋白的表达定位。结果:荧光显微镜观察显示,BPI-EGFP融合蛋白分布在整个细胞质中,并且在核膜周围有高表达。PCR扩增证实了BPIcDNA片段和EGFP片段已整合入MCF-7细胞基因组中。RT-PCR证明了hBPI和EGFP的融合蛋白在MCF-7细胞中在转录水平的表达。Western blot分析显示hBPI-EGFP以定位于细胞质和分泌到MCF-7细胞外两种形式表达。结论:hBPI-EGFP融合蛋白与天然的嗜中性的多核粒细胞中的定位和转运特点是一致的。