自贡冷吃兔生产环境中细菌的鉴定及溯源分析

利用自然沉降法和涂抹采样法对自贡冷吃兔生产环境进行微生物监测,采用传统培养法结合16Sr DNA测序技术鉴定,确定生产环境中细菌的主要种属,建立潜在污染细菌库,最后通过构建系统发育树进行溯源分析。本次研究从生产环境中共分离出61株菌,分别属于21个属;生产车间空气、生产人员、设备与器具均检出不动杆菌属细菌,其次为气单胞菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属;冷吃兔辅料处理间、辅料储存间、炒制间、冷却间、内包装间的菌落总数在生产过程中变化较小,原料处理间受人员操作影响变化较大。通过研究发现不动杆菌属在自贡冷吃兔生产环境中分布广泛;冷吃兔加工设备器具表面和人员手部是冷吃兔产品潜在的污染来源;真空包装冷吃兔腐败样品中芽孢杆菌属细菌主要来源于各生产车间空气微生物,葡萄球菌属细菌主要来源于炒制人员以及炒制间空气微生物。本研究深入了解了自贡冷吃兔生产环境的污染情况并能为其风险控制提供一定的科学依据。

自贡冷吃兔主要原辅料中细菌的鉴定及溯源分析

通过对冷吃兔生产所用冷鲜兔、辣椒、花椒、八角、芝麻、孜然、山奈、香料、桂皮、生产用水中的微生物数量进行测定并采用传统培养法结合16S rDNA测序技术鉴定,确定了原料和各种辅料中细菌的主要种属,最后通过构建系统发育树进行溯源分析。结果表明,原辅料中共分离76株菌,分布于20个属;不同原辅料菌落总数从大到小为:兔肉>孜然>辣椒>香料>生产用水>山奈>八角>桂皮>花椒>芝麻;不同原辅料含细菌属水平数量排序为:原料肉>辣椒、孜然>香料、生产用水>花椒、八角、芝麻、桂皮>山奈;不同原辅料含细菌种水平数量排序为:香料>原料肉>桂皮>辣椒>八角>山奈>孜然、花椒>芝麻、生产用水。在冷吃兔原辅料中细菌多样性高,芽孢杆菌属在原辅料中普遍存在,原料肉所含的细菌量最多。本研究深入了解了冷吃兔原辅料中的污染情况并能为从源头控制细菌种类与数量提供理论依据,更好的控制管理生产过程,使其安全性提升。

放线共生放线杆菌的分型和基因鉴定方法

放线共生放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ，Ａａ）是革兰氏阴性、兼性厌氧的球杆菌，它在牙周炎患者的牙周袋中检出率较高，有报告９０％‘以上青少年牙周炎的牙周损害部位有此菌定居［１］，因此，被认为是与牙周炎，...

RAPD用于不同弧菌分型、鉴定及影响因素

探讨随机扩增多态性DNA(RandomlyAmplified Polymorphic DNA,RAPD)在细菌分型中的实用性。方法:采用RAPD对5株O1群霍乱弧菌、2株非O1群霍乱弧菌和3株其它类弧菌进行分型并对试剂、DNA扩增仪等可能影响RPAD结果的因素进行比较。结果:1.分型:依据DNA指纹图谱特征将10株弧菌分成4类,即El

脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌分型中的应用

随着对细菌感染研究的日益深入，传统的细菌鉴定技术已不能很好地满足医院感染的诊断和流行病学调查的需要．表型分型方法如药敏试验等可用于检测疫情的爆发流行，但不能确认菌株之间的相关性。如今，从型、亚型、株甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要，因此分子生物学在细菌分型上得到了广泛应用。

宏基因组测序法在药品污染细菌鉴定与溯源中的应用研究

目的:评价宏基因组测序法在药品污染细菌鉴定和溯源中的应用。方法利用宏基因组测序法和分离培养法同时对两批中成药及检测实验室环境取样中的细菌进行鉴定和分型。宏基因组测序结果通过MetaPhlan和StrainSifter软件进行菌株水平的分析。结果经宏基因测序发现,药品与环境中均有大量的蜡样芽孢杆菌污染,且药品B18与环境样本HJ2中含有相同的蜡样芽孢杆菌菌组。培养法从药品和环境中共分离得到的5株蜡样芽孢杆菌,通过蜡样芽孢杆菌特异性聚合酶链式反应(PCR)扩增基因gyrA和panC序列构建NJ进化树,以及多位点序列分型(MLST),结果均显示药品B18中的蜡样芽孢杆菌菌株与环境样本HJ2的菌株同组。结论宏基因组测序技术是可靠的,且相比培养法,能够更全面发现具有潜在风险的细菌物种,同时也能准确地进行菌株水平的溯源分析,在药品污染菌鉴定与溯源中具有重要的应用价值。

16SrRNA序列分析在沙门氏菌鉴定分型中的应用

目的建立103株28种血清型沙门氏菌16SrRNA的进化树,了解沙门氏菌进化关系,为基于16SrRNA序列分析对沙门氏菌鉴定分型提供理论基础。方法使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增16SrRNA基因片段后进行测序,将序列提交到Genebank和RDP核糖体数据库进行比对,下载相关参考序列,使用MegAlign软件Clustal-V法构建进化树。结果根据16SrRNA同源性能够把103株沙门氏菌聚类成不同群,部分菌株可以鉴定到血清型,部分菌株可以在血清型内进一步区分,虽然与传统血清学分型不能一一对应,但是能形成独立的分型系统。结论 16SrRNA基因序列分析是对沙门氏菌进行鉴定分型及溯源分析的有效方法。

宏基因组测序法对林可霉素利多卡因凝胶中污染细菌的鉴定与溯源研究

目的:评价宏基因组测序法在药品污染细菌鉴定和溯源中的应用。方法:分别通过培养法、扩增子测序法和宏基因组测序法,对2批微生物限度控制菌检查中检出未知微生物的林可霉素利多卡因凝胶药剂进行菌种鉴定和溯源。培养法分离得到的细菌,通过革兰氏染色、生化反应、生物质谱法、16srDNA测序及芽孢杆菌特异性PCR方法进行菌种鉴定,并通过多位点序列分型(MLST)法对药品和环境中均检出的蜡样芽孢杆菌进行菌株分型。宏基因组测序结果通过MetaPhlan软件进行菌株水平的分析。结果:MLST与Meta⁃Phlan结果均显示药品与检测环境中存在同一组蜡样芽孢杆菌,显示药品中的蜡样芽孢杆菌极有可能来自检测环境的污染。培养法与宏基因组测序法均在药品中检出污染微生物土壤短芽孢杆菌、类芽孢杆菌及新芽孢杆菌,但扩增子测序还在环境样本中检出上述细菌,因此不能排除药品中此类污染菌来自检测环境的可能性。结论:宏基因组测序技术相比培养法,能够更全面发现具有潜在风险的微生物,同时也能准确地进行菌株水平的溯源分析,在药品污染菌鉴定与溯源中具有重要的应用价值。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析技术在微生物鉴定与分型中的应用

微生物的鉴定方法有很多种,这些方法基于表型、免疫学、遗传学等,目前普遍采用16S rRNA和18S rRNA基因测序为标准,但这些方法也有一些局限性,费时费力、操作复杂、劳动力和试剂成本都很高,限制了在常规微生物检测实验室的普及与推广。近年来,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)在微生物学领域的应用越来越重要,与应用于微生物鉴定的其他技术不同,MALDI-TOF MS更快速、准确、经济且易于操作。随着样品制备、数据库丰富和算法优化的发展,使用MALDI-TOF MS进行鉴定的准确性和速度不断提高。虽然大多数研究都集中在细菌上,但这项技术也应用于真菌和病毒。本文对MALDI-TOFMS技术对细菌、真菌、病毒鉴定与分型的研究进展以及目前该技术的局限性进行综述,旨为该技术在临床诊断、食品检测等领域的多种应用奠定基础。

富顺香辣酱生产环境食源性致病细菌的分析及溯源分析

以菌落总数、肠杆菌科菌为监测指标,对富顺香辣酱生产环境进行动态监控,并对分离出的食源性致病细菌进行革兰氏染色、氧化酶实验、葡萄糖实验等生理生化鉴定和16S rDNA测序,最后通过构建系统发育树进行溯源分析。结果表明,生产人员和各车间中共鉴定出14株菌种,致病菌占13株,其中Agrobacterium tumefaciens为非致病菌;在设备表面未检出肠杆菌科菌;各车间空气中菌群密度由低到高为:罐装车间<调配车间<粉碎车间<原料库房。加工过程中空气菌群密度由生产前较低到生产过程中较高再随着生产结束逐渐降低。综上,通过溯源发现各车间和生产人员中分离出的菌与原料库房环境中的菌具有较高同源性,本研究为香辣酱生产环境的污染情况风险控制提供一定的科学依据。

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应指纹图谱技术用于细菌分型的研究进展

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)指纹图谱技术利用普遍存在于生物体内的ERIC进行引物设计,通过基因扩增,获得能够表征其基因组结构的产物,该方法简单易行、重复性好、用时短,被广泛应用于细菌基因分型及同源性判别。本文简述细菌分型的研究背景和ERIC-PCR指纹图谱技术的原理及特点,归纳该技术在细菌基因分型方面的优缺点及其在常见食源性致病菌基因分型中的应用现状,并对ERIC-PCR指纹图谱技术应用于乳品企业污染菌溯源的研究进行展望。

14株伯克霍尔德菌的鉴定分析

目的对从菌种保藏中心获得以及样品分离的14株伯克霍尔德菌进行鉴定分析,为该菌的鉴定和溯源分析提供参考。方法分别用生理生化(API20NE和Biolog碳源分析系统)、基因型(自动化核糖体分型、16SrDNA和recA序列分析)的方法对11株标准菌株和3株未知菌进行了鉴定,并对结果进行了分析比较。结果生理生化的方法能够鉴定到属的水平,Biolog能够区分BCC与非BCC类群微生物;16SrDNA序列分析能够鉴定到属水平,对于非BCC的部分菌可以鉴定到种水平,并且能够将BCC正确分类;recA序列分析能够将包含BCC的部分菌正确鉴定到种水平;Riboprinter技术能够鉴定到属水平,但是该技术能够对菌进行溯源分析。结论在进行该菌的鉴定时,可以参考中国药典2015年版四部9204微生物鉴定技术指导原则的要求,根据自身的需求、技术能力以及能够承担的成本,选择适宜的鉴定方法和技术,依据多相鉴定原则进行鉴定分析,第一步判断是否属于伯克霍尔德菌属,第二判断是否属于BCC,第三尽可能准确鉴定到种水平,有必要的情况下进行溯源分析以确认污染来源。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析技术在微生物检测与鉴定中的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在微生物检测与鉴定中有着广泛的应用前景。本文着重介绍了MALDI-TOF MS分析技术微生物检测原理、前处理技术及其在微生物检测、鉴定、分型、溯源分析中的应用。与传统的检测鉴定方法相比,MALDI-TOF MS分析技术表现出成本低、检测时间短、易于操作等显著的技术优势。随着微生物质谱数据库以及分析方法的逐渐完善,该技术将成为微生物实验室致病菌快速检测鉴定的重要分析手段。

339株非结核分枝杆菌临床分离株菌种鉴定及耐药性分析

回顾性分析2014年3月至2019年3月天津市海河医院经罗氏培养和"DNA微阵列芯片技术"确定的339株非结核分枝杆菌(NTM),并对其药物敏感性试验(简称"药敏试验")结果进行分析。339株NTM临床分离株中,排在前3位者分别为胞内分枝杆菌38.6%(131/339)、龟-脓肿分枝杆菌21.2%(72/339)、堪萨斯分枝杆菌18.3%(62/339)。体外药敏试验显示胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和龟-脓肿分枝杆菌对8种抗结核药品(异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星)耐药率情况为:胞内分枝杆菌的耐药率分别为95.6%(108/113)、82.3%(93/113)、94.7%(107/113)、54.0%(61/113)、92.0%(69/75)、81.3%(61/75)、85.3%(64/75)、87.5%(49/56);堪萨斯分枝杆菌的耐药率分别为100.0%(54/54)、3.7%(2/54)、98.1%(53/54)、11.1%(6/54)、95.0%(38/40)、90.0%(36/40)、27.5%(11/40)、13.8%(4/29);龟-脓肿分枝杆菌的耐药率分别为96.9%(62/64)、93.8%(60/64)、95.3%(61/64)、92.2%(59/64)、88.4%(38/43)、86.0%(37/43)、88.4%(38/43)、87.1%(27/31)。临床分离NTM菌种以胞内分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌为主,其中胞内分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌对常用一线、二线抗结核药品具有较高的耐药性,堪萨斯分枝杆菌对利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卷曲霉素的耐药率低。

无菌检查中污染微生物多样性分析及数据偏差调查

目的对无菌检查中污染微生物进行多样性分析及数据偏差调查。方法以曲安奈德注射液为例,按2020年版《中国药典》方法进行无菌检查,对污染微生物分离纯化后进行生化鉴定及基于16SrRNA的微生物多样性分析,与实验环境中的环境菌库进行比较并溯源,同时进行微生物数据检查偏差数据调查(MDD)。结果样品中检出表皮葡萄球菌、克式柠檬酸杆菌、唾液链球菌,且均在试验环境菌库39株环境菌中。MDD结果表明,样品中污染的微生物是由操作人员未完全按无菌隔离器使用的标准操作规程进行规范操作而导致的。即样品中污染的微生物来源于环境,而非样品本身,试验结果无效,应重试。结论对无菌检查中污染微生物进行溯源及数据偏差调查,可确认其阳性结果的准确性。

液相芯片技术在沙门菌抗原缺失血清型鉴定中的应用

目的探讨液相芯片技术在检测、鉴定抗原缺失的沙门菌中的应用。方法依据国标GB 4789.4-2016和盲样考核手册,对3份考核盲样进行增菌分离培养和生化鉴定,分别采用血清凝集和多重PCR液相芯片技术进行血清型分型,比较其优缺点。结果3份考核样经分离、纯化,以血清凝集法和多重PCR液相芯片技术进行分型分析,鉴定结果一致,2份样品为阿贡纳沙门菌和婴儿沙门菌,1份样品为未检出。2017S-10(5)-1 H相中第二相未观察到凝集现象,2017S-10(5)-3第一相观察不到凝集现象,分别经3次、2次诱导后才获得鉴定结果,分别耗时3d、2d,平均成本为1 000元/样本;液相芯片技术分型耗时4h,平均成本为500元/样本。结论利用液相芯片技术能够快速、准确鉴定抗原缺失血清型沙门菌,可在有条件的机构推广。

大肠杆菌和绿脓杆菌混合感染引起的水貂出血性肺炎的鉴定

为了鉴定引起水貂发生出血性肺炎的病原体,试验采用病原分离鉴定、分离株16S rRNA扩增与序列分析、分离株对小鼠致病力试验、分离株血清分型鉴定、大肠杆菌H基因型鉴定、分离株药敏试验和分离株动物感染试验对来自山东省、辽宁省、河北省和黑龙江省的28份具有典型出血性肺炎症状死亡水貂的病料进行鉴定。结果表明:混合感染12例,单一病原菌感染16例,镜检可见短小的阴性杆菌和两端钝圆的阴性长杆菌;16S rRNA扩增与序列分析共分离出22株绿脓杆菌和18株大肠杆菌,其中有4株对小鼠致死率达到50%以上,9株对小鼠致死率在10%~40%;从22株绿脓杆菌中共分离出8株G型、7株E型和7株D型,未检测出大肠杆菌血清型,大肠杆菌H基因型为H11;绿脓杆菌分离株对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等6种药物敏感,大肠杆菌分离株对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等10种药物均耐药;大肠杆菌和绿脓杆菌分离株均可导致水貂死亡并造成肺泡壁毛细血管瘀血、脾脏淋巴细胞数量减少、肺脏上皮细胞坏死、红髓内巨噬细胞数量增多等明显病理变化。说明目前引起水貂出血性肺炎的病原体已由传统的绿脓杆菌单一感染逐渐转变为大肠杆菌和绿脓杆菌的混合感染。

39株腹泻病病原菌鉴定报告

为了明确现阶段腹泻病原菌的流行特点,对39株由地方医院送检菌株进行了调查鉴定工作.在菌株鉴定中,我们利用常规生化反应与API生物鉴定新技术相对照的方法,分别鉴定致病性肠道弧菌25株,致病性肠道杆菌14株,对于肠道致病菌的流行趋势进行了系统的分析.

呼和浩特市首次霍乱爆发的病原菌鉴定

采集土左旗北什轴乡西红岱村病人和密切接触者粪便９７７ 份样品进行霍乱弧菌检验。对检出的１０ 株可疑菌株进行形态特征、培养特征、生化反应、血清学凝集反应、噬菌体分型等系统鉴定。鉴定结果确认引起呼市首次霍乱爆发的病原菌为霍乱弧菌埃尔托生物型、小川血清型、１ｂ

细菌核心基因组多位点序列分型(cgMLST)与溯源评价

细菌分型与溯源对食品安全监管、流行病学调查具有重要意义。全基因组分型技术以全基因组多位点序列分型(whole genome multilocus sequence typing,wgMLST)、核心基因组多位点序列分型(core genome multilocus sequence typing,cgMLST)、全基因组单核苷酸多态性(whole genome single nucleotide polymorphism,wgSNP)等为代表,具有分辨率高、重复性好的优点,能够实现精准溯源,逐渐成为细菌分型和溯源的主流技术。然而,wgMLST、wgSNP消耗巨大的计算资源,而且wgSNP对测序的准确性要求极高,推广难度大;相比之下,cgMLST需要较少的计算能力,应用性更强。本文重点介绍了细菌核心基因组的筛选、等位基因的赋值、cgMLST分型原理及操作步骤和细菌基因组溯源评价,为细菌的cgMLST分型与溯源提供了技术指导,有助于保证cgMLST分型结果的客观性和可比性。