IL-1β诱导小鼠椎间盘软骨终板细胞炎性退变的细胞模型研究

目的通过IL-1β体外诱导小鼠椎间盘软骨终板细胞建立退变细胞模型,并研究其作用机制。方法 10 ng/ml IL-1β诱导小鼠椎间盘软骨终板细胞24 h后,用cck-8法检测不同时间点IL-1β对软骨终板细胞增殖作用的影响,透射电镜观察细胞退变情况,细胞免疫荧光和Western blot检测细胞退变相关蛋白表达。结果诱导组细胞较正常组细胞增殖减慢,细胞肥大化比例增加,出现线粒体肿胀、核扭曲、染色质边集,染色质及胞质松散等细胞坏死及凋亡表现,且colⅡ、Aggrecan表达下降,colⅩ、MMP-1、MMP-3、MMP-13、TIMP-1表达增加。结论 IL-1β可诱导软骨终板细胞发生退变。

IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响

目的探讨IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响。方法分离培养兔软骨终板细胞,通过甲苯胺兰染色等方法鉴定后,分别加入不同浓度的IL-6,MTT法测定不同时间点软骨终板细胞增殖活性的变化;流式细胞仪检测软骨终板细胞生长周期的变化;RT-PCR检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化。结果10、50、100ng/mlIL-6对软骨终板细胞的增殖无影响,50ng/mlIL-6对软骨终板细胞细胞周期无影响,10、50ng/mlIL-6均对Aggrecan mRNA的表达无影响,仅50ng/ml浓度时IL-6可降低CollagenIIa mRNA的表达。结论较大剂量IL-6时可抑制软骨终板基质合成,从而促进椎间盘的退变。

苦杏仁苷对IL-1β诱导后大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度的苦杏仁苷对IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡的影响,并进一步探讨其作用的可能机制。方法从1月龄SD大鼠椎间盘中分离软骨终板并培养,经鉴定后,随机分为正常组、诱导组、苦杏仁苷10-2、10-3、10-4、10-5mol·L-1给药组,采用流式细胞仪检测大鼠椎间盘软骨终板细胞的凋亡,Real-time PCR(RT-PCR)检测凋亡相关基因的表达情况,Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果不同浓度的苦杏仁苷能够拮抗IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡。流式分析显示各浓度的苦杏仁苷可以降低IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞的凋亡比例;RT-PCR结果提示苦杏仁苷各浓度组可拮抗IL-1β上调Bax mRNA的表达,下调Bcl-2 mRNA的表达,各组与诱导组相比较,其差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示苦杏仁苷10-4mol·L-1给药组能够拮抗IL-1β上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达。结论苦杏仁苷能够拮抗IL-1β诱导大鼠椎间盘软骨终板细胞的凋亡,起到延缓椎间盘退变的作用。

IL-1β对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响

目的:探讨IL-1β对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响。方法:分离培养兔软骨终板细胞,通过甲苯胺兰染色等方法鉴定后,分别加入不同浓度的IL-1β,用MTT测定不同时间点软骨终板细胞增殖活性的变化;免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Fas、caspase-3表达的变化;RT-PCR检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化。结果:50ng/ml、100ng/ml浓度IL-1β可抑制细胞增殖;10ng/ml、50ng/ml浓度IL-1β可促进Bax、Fas、caspase-3的表达,但仅浓度为50ng/ml时才可降低Bcl-2的表达;10ng/ml、50ng/ml浓度IL-1β可降低Aggrecan、Collagen IIa mRNA的表达。结论:IL-1β可抑制软骨终板细胞的增殖及基质合成,促进软骨终板细胞凋亡,从而促进椎间盘的退变。

SIRT1去乙酰化修饰p53抑制IL-1β介导的软骨终板细胞衰老

目的 探讨沉默信息调节因子2同源蛋白1（silent information regulation 2 homolog-1,SIRT1）对软骨终板细胞衰老的调控作用及相关机制。方法 IL-1β处理软骨终板细胞,通过细胞周期检测、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、衰老相关通路激活情况,判断IL-1β对软骨终板细胞衰老的影响;调控SIRT1的表达或活性后,通过上述方法明确SIRT1对IL-1β介导软骨终板细胞衰老具有调控作用,并通过抑制相关通路活性,进一步探讨SIRT1调控软骨终板细胞衰老的机制。结果 IL-1β处理软骨终板细胞后G_1期细胞比例明显增加（P 〈0. 05）,衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性率升高（P 〈0. 05）,衰老相关通路p53-p21中p53、p21 mRNA表达水平明显增加（P 〈0. 05）;增加SIRT1的表达后p53蛋白乙酰化水平明显降低（P 〈0. 05）,p21蛋白表达明显降低（P 〈0. 05）,G_1期细胞比例较对照组明显较少（P 〈0. 05）,β-半乳糖苷酶染色阳性率明显降低（P 〈0. 05）,而尼克酰胺抑制SIRT1活性后p53蛋白乙酰化水平升高（P 〈0. 05）,p21蛋白表达增加（P 〈0. 05）,G_1期细胞比例较对照组明显增加（P 〈0. 05）,β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增高（P 〈0. 05）。无论使用尼克酰胺抑制SIRT1激活p53-p21通路与否,在使用p53抑制剂PFT-α后,p21的表达、G_1期细胞比例、β-半乳糖苷酶染色阳性率均无明显变化（P〉0. 05）。结论 IL-1β介导了软骨终板细胞的衰老,SIRT1能够通过去乙酰化修饰p53抑制IL-1β介导的软骨终板细胞的衰老。

外源性转化生长因子-β_1作用下胎儿软骨终板细胞Ⅱ型胶原与蛋白多糖的相关性

目的观察外源性转化生长因子-β_1(TGF-β_1)作用下胎儿软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的变化及相关性。方法用含10μg/L外源性TGF-β_1培养基培养第2代胎儿软骨终板细胞,分别培养0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d。Western blot和RT-PCR检测培养细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖及其mRNA的表达。结果 0天与第1天之间相比较,第4天、第5天与第6天之间相互比较,Ⅱ型胶原和蛋白多糖及其基因表达的差异皆无统计学意义(P>0.05);第1天、第2天、第3天和第4天之间相互比较,Ⅱ型胶原和蛋白多糖及其基因表达的差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅱ型胶原和蛋白多糖的mRNA表达及蛋白表达均呈正相关(分别为R=0.9991和R=0.9931)。结论 TGF-β_1能促进体外培养的胎儿软骨终板细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖,且二者在变化过程中具有显著的相关性。

两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究

目的比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异。方法提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25%的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02%Ⅰ型胶原酶和0.02%Ⅱ型胶原酶在37℃消化3次,每次1 h;将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心,获取细胞并进行培养与传代;对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理,比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异。结果 1)细胞计数:Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/m L、5.50×104个/m L、6.25×104个/m L,获得软骨终板数目(5.83±0.31)×104个/m L;Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/m L、9.50×104个/m L、8.25×104个/m L,获得软骨终板数目(8.83±0.51)×104个/m L,Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组;2)细胞形态:两组软骨终板细胞多呈多角形,胞核大而圆,形态无明显差异。3)细胞增殖:Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD值为(0.561±0.003),Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为(0.562±0.002),组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养。

退变腰椎软骨终板细胞生物学特征实验研究

目的通过对人腰椎软骨终板细胞的培养,观察细胞的形态学和生物学性状,探讨影响其生物学行为的因素。方法取腰椎退变和未退变终板软骨细胞,在加10%灭火胎牛血清的DMEM培养液中培养,建立体外终板软骨细胞培养模型,采取HE染色、绘制细胞生长曲线、Annexin-V/PI法、免疫组织化学染色、real-timePCR等方法,对细胞形态、活力、生长情况、凋亡、及软骨细胞基质合成进检测。结果软骨终板细胞可以在体外进行培养;终板软骨细胞的生长情况及细胞表型类似关节软骨,有II型胶原表达。退变软骨终板较未退变软骨终板活性及增殖能力降低,细胞凋亡增加,Ⅱ型胶原合成减少。结论体外成功培养了人腰椎终板软骨细胞,并证明了退变软骨终板细胞凋亡增加,而活性降低,基质合成减少。该研究也为进一步研究终板软骨的生物学性状奠定基础。

软骨终板干细胞及骨髓间充质干细胞对软骨终板细胞增殖分化的影响

背景组织工程作为一项年轻的技术获得了越来越多脊柱医学研究者的关注。但组织工程种子细胞的选择仍无明确标准。目的获取并鉴定软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cell,CESC)和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC),通过对比探明CESC是否有作为组织工程种子细胞的潜在可能。方法原代培养SD大鼠软骨终板细胞(cartilage endplate cell,CEP),甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型,通过单克隆法筛选培养CESC和BMSC;三系诱导分化验证CESC和MSC干细胞特性;取P3代CEP、CESC和BMSC进行非接触式共培养,在1 d、3 d、5 d、7 d,CCK-8检测三组Transwell小室下层CEP增殖,并绘制增殖曲线;流式细胞仪检测共培养7 d后三组下层小室CEP凋亡变化,RT-qPCR检测CEP表型基因ACAN、COLⅡ、Sox9表达变化。结果甲苯胺蓝染色显示原代培养的CEP能够分泌软骨相关的多糖物质,如糖胺聚糖等,且具有特征性多角形形态,呈铺路石样分布;通过单克隆法分离出的CESC和BMSC经三系诱导分化后,茜素红染色能够观察到被染成红色的钙结节,油红O染色观察到细胞周围出现大量类圆形红色脂滴形成,番红染色观察到软骨细胞特异性分泌的聚集蛋白聚糖出现。CCK-8检测表明CESC组和BMSC组增殖能力均强于CEP组,且CESC组增殖能力强于BMSC组,三组CEP凋亡水平无统计学差异;RT-qPCR结果表明三组CEP共培养第1-7天ACAN、COL2A1和Sox9表达均呈波峰状改变,第3天表达水平最高。第1天、第7天三组软骨表型基因表达ACAN、COL2A1和Sox9差异无统计学意义;第3天、第5天CESC组表达高于BMSC组和CEP组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CESC和BMSC通过非接触式共培养均能够增强CEP增殖和软骨表型的表达,且前者作用明显更强。

腰椎软骨终板细胞凋亡与椎间盘退变的关系

目的:建立脊柱退变的动物模型,确定脊柱软骨终板细胞凋亡在脊柱退变过程中的意义。方法:选取健康大白鼠24只,随机分为实验组和对照组。建立模型后,在不同时间段对腰椎标本行矢状位切片,分离软骨终板和椎间盘。计数椎间盘软骨终板细胞凋亡数量,评估软骨终板消失状况。结果:腰椎间盘退变的组织学表现,HE染色观察腰椎间盘细胞凋亡状况,TUNEL染色比较对照组和实验组在18周均有明显差别。结论:脊柱退变模型显著增加了软骨终板细胞凋亡数量,腰椎间盘退变过程加速,所以软骨终板细胞凋亡是椎间盘发生退行性变的重要原因。

丹酚酸A调控miR-940与miR-576-5p促进退变终板软骨细胞修复的作用研究

目的:观察丹酚酸A(salvianolic acid A,SAA)对退变终板软骨细胞(cartilaginous endplates cells,CEPCs)的干预作用,及其调控的潜在非编码RNA(micro-RNA,miRNA)作用靶点。方法:从腰椎间盘手术标本中分离CEPCs,用不同浓度SAA(2、5、10μM处理24、48、72 h,利用CCK-8检测细胞活性确定SAA的最适剂量和干预时间。通过阿利新蓝染色和对血小板反应蛋白解整合素金属肽酶-5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-5,ADAMTS-5)、基质金属肽酶3(matrix metallopepridase 3,MMP-3)、Ⅱ型胶原a1(clollagen typeⅡa1,Col2a1)的蛋白表达检测,分析SAA对IL-1β诱导的退变CEPCs的干预作用。进一步结合生信分析,以及实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qRT-PCR)与Western blot检测,并应用miRNA模拟物(miR-mimics)与抑制剂(miR-inhibitor),验证SAA对潜在靶miRNAs的调控作用。结果:10μM SAA处理48 h显著提高了CEPCs活性,增加了白细胞介素(interlenkin-1β,IL-1β)所抑制的糖胺聚糖积累与Col2a1表达,并降低了细胞基质中ADAMTS-5与MMP3表达(P<0.05)。通过生物信息分析筛选与差异基因表达检测,确定了SAA的潜在靶miRNAs为miR-940和miR-576-5p。进一步在SAA处理组中加入miR-940-mimic或miR-576-5p-mimic,与SAA处理组相比过表达miR-940或miR-576-5p后CEPCs基质中ADAMTS-5与MMP3表达显著升高,Col2a1表达显著降低。结论:SAA能够提高CEPCs活性,改善退变CEPCs的基质成分表达,而SAA的调控作用与抑制miR-940和miR-576-5p表达有关,两者可能是SAA调节CEPCs退变的作用靶点。

三种大鼠椎间盘细胞提取、鉴定及在单层和微团培养中的基质表达

背景:目前获得椎间盘原代细胞的方法大多较繁琐,且缺少同时提取纤维环、终板与髓核原代细胞的相关报道,因此找到同时提取3种细胞的方法十分关键。目的:探索一种同时提取并培养大鼠来源3种椎间盘细胞(纤维环、终板与髓核)的方法,对之进行鉴定并探究单层与微团培养对细胞外基质的影响。方法:取材自3周龄雄性SD大鼠椎间盘组织,从其中分离出软骨终板、髓核与纤维环组织。针对髓核及纤维环组织,先使用0.1%链酶蛋白酶E于37℃消化30 min,然后使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h来释放其中的细胞;针对终板组织,直接使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h来释放其中的细胞。将去除消化酶后的细胞接种于含有培养基的培养皿中,并观察细胞形态;通过实时定量荧光PCR与蛋白印迹实验检测各细胞标记物的表达水平;单层或微团培养大鼠原代纤维环细胞与软骨终板细胞,并采用阿尔新蓝与番红染色检测细胞外基质的表达能力。结果与结论:①3种椎间盘细胞均在培养4 d后开始贴附在皿底,并逐渐展现出增殖的活力;培养至第8天时,3种细胞增殖显著,形态均呈梭形,其中髓核细胞中存在多囊泡的脊索样细胞;②通过实时定量荧光PCR和/或蛋白免疫印迹实验发现原代髓核细胞中K19与Car3表达较高,原代纤维环细胞中Sparc与Bgn表达较高,原代软骨终板细胞中Pth1r与Lars2表达较高;③原代纤维环、软骨终板细胞微团培养后,经阿尔新蓝与番红染色证明这种培养方式相较于单层培养能够提高细胞外基质的表达能力;④结果表明,通过此次实验方法提取并培养获得的原代椎间盘细胞形态较好并具有较高的胞外基质表达水平,这一成果有望为科研人员提供一种新的科研工具,帮助科研人员更好地理解椎间盘生物学。

循环牵张力作用下髓核外泌体对终板软骨细胞的影响

背景:终板软骨细胞在髓核-终板复杂的微环境中受到多种因素的调节,异常应力所引发的微环境改变对终板软骨细胞的影响尚需深入探究。目的:观察循环牵张力条件下髓核细胞外泌体的分泌情况,以及应力刺激髓核外泌体对终板软骨细胞的影响。方法:体外分离培养人腰椎髓核细胞,应用FX-5000T系统对髓核细胞进行循环牵张力加载,采用磁珠法提取应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体,流式细胞术检测外泌体纯度与浓度。以PKH67荧光染料标记外泌体,将应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体分别与终板软骨细胞共孵育24 h,以单独培养的终板软骨细胞为对照,观察终板软骨细胞对外泌体的摄取情况、终板软骨细胞的凋亡和活性以及终板软骨细胞基质中相关基因的mRNA表达。结果与结论:①一定条件的循环牵张力刺激可促进髓核细胞外泌体分泌,且该条件下的外泌体颗粒浓度高于非应力条件;②倒置荧光显微镜下可见,应力与非应力条件下的髓核细胞外泌体均可被终板软骨细胞摄取;③CCK8与流式细胞术检测显示,应力组终板软骨细胞的活性低于对照组(P<0.05)、凋亡率高于对照组(P<0.05);④RT-PCR检测显示,与对照组比较,非应力组基质金属蛋白酶3、骨形态发生蛋白2 mRNA表达增加(P<0.05);与对照组比较,应力组Ⅱ型胶原mRNA表达降低(P<0.05),解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3及β-连环蛋白mRNA表达升高(P<0.05);与非应力相比,应力组Ⅱ型胶原mRNA表达降低(P<0.05),解聚蛋白样金属蛋白酶5、基质金属蛋白酶3及骨形态发生蛋白2 mRNA表达升高(P<0.05);⑤结果表明一定条件的应力可促进髓核细胞外泌体分泌,且该条件下的外泌体可抑制终板软骨细胞的活性,造成细胞基质合成与分解代谢紊乱。

白藜芦醇通过调节SIRT1活性促进退变椎间盘终板软骨细胞合成细胞外基质

目的探讨白藜芦醇(Res)干预对退变椎间盘终板软骨细胞(DEC)合成细胞外基质的影响。方法老年腰椎间盘突出症患者的终板软骨细胞培养、传代,P2代细胞随机分为5组,即Res组、二甲基亚砜对照组、Res+尼克酰胺(Nam)组、Res+siRNA转染组及空白对照组。各组进行对应处理后检测沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)、Ⅱ型胶原(COLA2)、蛋白聚糖聚合物(aggrecan)及SIRT1 mRNA表达水平。结果 Res干预上调DEC SIRT1 mRNA及蛋白的表达,促进细胞外基质(COLA2、aggrecan)的合成;Nam及siRNA干预分别有效抑制了SIRT1酶活性及SIRT1 mR-NA的表达,并抑制了细胞外基质的合成。结论 Res可促进DEC合成细胞外基质,抑制椎间盘软骨终板退变,其机制与调节SIRT1活性有关。

大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型的建立

[目的]建立大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型。[方法]为了模拟椎间盘内部低营养低代谢环境,采用低胎牛血清培养法培养椎间盘软骨终板细胞分别含0%,1%,3%,5%,8%,10%胎牛血清,设置不同浓度梯度筛选最佳浓度,检测凋亡率、凋亡蛋白表达及caspase酶活性。[结果]低胎牛血清培养组细胞发生形态改变,DAPI染色阳性细胞增多;流式细胞仪检测凋亡率随着FBS浓度降低而升高,1%为最有效诱导凋亡浓度;Western blot示FAS、caspase-3、PARP、细胞色素C表达在1%FBS组明显高于10%时,同时caspase-3/8/9酶活性增高。[结论]低胎牛血清培养法能诱导体外培养的软骨终板细胞发生凋亡,最终会引起细胞功能丧失和椎间盘退变,caspase家族可能参与了这一过程。

白藜芦醇激活IGF-1R/AKT通路对退变椎间盘终板软骨细胞合成细胞外基质的影响及其机制

目的探讨白藜芦醇对椎间盘软骨终板细胞合成细胞外基质的影响及其机制。方法椎间盘软骨终板细胞培养,传代,P2代细胞培养48 h后,随机分为5组,各组加入对应试剂培养12 h后终止培养,检测胰岛素样生长因子(IGF)-1R、pIGF-1R、蛋白激酶B(AKT)、pAKT、Ⅱ型胶原(COLAⅡ)、aggrecan的表达变化。结果白藜芦醇干预后IGF-1R及AKT磷酸化水平显著增加,COLAⅡ、aggrecan基因转录水平上调,COLAⅡ、aggrecan合成增加;加入AG1024及SH-5抑制了IGF-1R及AKT磷酸化激活,COLAⅡ、aggrecan基因转录水平下降,COLAⅡ、aggrecan合成减少。结论白藜芦醇可促进退变椎间盘软骨终板细胞合成细胞外基质COLAⅡ、aggrecan,抑制软骨终板退变,其机制与激活IGF-1R/AKT信号通路有关。

体外培养胎儿软骨终板细胞Ⅱ型胶原与蛋白多糖表达相关性

目的观察体外培养过程中胎儿软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖变化的相关性。方法采用含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养胎儿软骨终板细胞,应用Western blot和RT-PCR法检测第1代到第8代胎儿软骨终板细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖及其mRNA的表达情况,直线回归分析Ⅱ型胶原和蛋白多糖及其mRNA表达的相关性。结果第1～8代培养细胞的Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA及蛋白表达水平两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);Ⅱ型胶原及其mRNA表达与蛋白多糖及其mRNA的表达呈明显正相关(r=0.994 7,P=0.014;r=0.945 3,P=0.017)。结论抑制Ⅱ型胶原或蛋白多糖中一种物质下降可同时阻止另一种物质下降,从而延缓椎间盘退变发生。

白藜芦醇干预对已退变椎间盘终板软骨细胞SIRT1表达的影响

目的探讨不同浓度及不同时间的白藜芦醇干预对退变椎间盘终板软骨细胞沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)表达的影响。方法老年患者的终板软骨细胞培养、传代,P2代细胞随机分组,分别用不同浓度及不同作用时间的白藜芦醇干预,终止培养后检测SIRT1蛋白及mRNA表达水平。结果与空白对照组相比较,DMSO组SIRT1蛋白及mRNA表达无显著差异(P>0.05);白藜芦醇干预的浓度在12.5μmol/L、作用24 h,以及浓度在50μmol/L、作用12 h以上时能够显著促进已退变椎间盘终板软骨细胞表达SIRT1蛋白及mRNA(P<0.05)。结论白藜芦醇干预可促进退变椎间盘终板软骨细胞表达SIRT1蛋白及mRNA,且该作用呈现浓度、时间依赖关系;0.1%DMSO对细胞表达SIRT1蛋白无抑制作用。

分化抑制因子1基因对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特性基因表达的影响

目的探讨通过慢病毒干扰细胞分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)基因表达,对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特异性基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达的影响。方法取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织分离培养软骨终板细胞,取第2代细胞进行实验。使用绿色荧光蛋白慢病毒、高表达Id1基因慢病毒及RNA干扰(RNA interference,RNAi)Id1基因慢病毒转染椎间盘软骨终板细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量PCR及Western blot法观察慢病毒转染情况以及对细胞Id1基因和蛋白表达的影响。使用上述慢病毒与BMP-2慢病毒共同转染软骨终板细胞,并设置BMP-2慢病毒转染对照,通过实时荧光定量PCR、ELISA法观察Id1基因表达差异对BMP-2促进椎间盘终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响。结果慢病毒转染对细胞形态无明显影响,高表达Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒能有效转染软骨终板细胞,并干扰内源性Id1基因的表达。BMP-2慢病毒和高表达Id1基因慢病毒共同转染软骨终板细胞后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达和蛋白合成均显著高于BMP-2慢病毒、高表达Id1基因慢病毒单独转染,差异有统计学意义(P<0.05)。Id1基因表达下降后,软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖合成明显下调(P<0.05)。结论 Id1基因表达上调能协同BMP-2促进软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达。

兔椎间盘终板细胞凋亡与水通道蛋白-1的关系

目的探讨水通道蛋白（AQP）-1与椎间盘终板细胞凋亡的关系及意义。方法将23个含终板的完整椎间盘分为4组：A组直接把取出的新鲜完整的椎间盘作为对照（椎间盘×5），B组为无干预组[进行培养但不加白细胞介素（IL）-1β，椎间盘×6]，C组加入10μ/L IL-1β（椎间盘数×6），D组加入30μg／L IL-1β（椎间盘数×6）。B、C、D组培养2周后取组织的相邻切片，免疫组织化学检测AQP-1和Caspase-3的表达。结果免疫组织化学显示A组中AQP-1和Caspase-3阳性细胞率分别为（88．4±1．1）％和（5．5±0．8）％，B组阳性细胞率分别为（86．7±1．4）％和（6．3±1．6）％，C组中阳性细胞率分别为（42．8±2．2）％和（62．0±1．7）％，D组阳性细胞率分别为（30．5±2．O）％和（71．8±1．23）％，AQP-1与Caspase-3表达呈负相关。结论AQP—1表达减少与终板细胞的凋亡密切相关。