两种不同单克隆法筛选大鼠腰椎终板软骨干细胞能力的比较

目的比较两种不同的单克隆方法获取大鼠腰椎终板软骨干细胞筛选能力。方法获取大鼠腰椎终板软骨组织后,Ⅱ型胶原酶消化法获取原代细胞(P0),将P0代细胞按照100个/cm^2、200个/cm^2、300个/cm^2的密度接种于10 cm培养皿上,为P0组;将原代细胞先接种于T25培养瓶,待其贴壁融合30%~40%时再消化,按照100个/cm^2、200个/cm^2、300个/cm2的密度接种于10 cm培养皿,为P1组。倒置相差显微镜下观察两组细胞集落形成速度及生长形态;0.1%结晶紫染色,计算两组的集落形成百分比;使用干细胞表面标记物CD44和CD90,流式细胞仪检测两组获取干细胞的纯度。结果将两组的细胞按上述密度进行培养后,P1组细胞集落形成时间早于P0组,且集落数目也较P0组多,但镜下观察其细胞形态及集落形态不如P0组;P1组的集落形成数目远大于P0组,两组按照100个/cm^2的密度接种时,其细胞集落形成百分比最大;流式细胞仪检测,对于CD44,P0组表达率(92.17±1.26)%,P1组为(74.37±2.63)%;对于CD90,P0组表达率(95.30±3.42%),P1组为(90.87±1.42%)。结论两种不同的单克隆方法都可以筛选出大鼠腰椎终板软骨干细胞,但是使用原代细胞直接接种时,得到的干细胞纯度更高。

脱细胞软骨基质对于大鼠腰椎终板软骨干细胞分化的影响

[目的]制备家猪脱细胞软骨基质,探索其对大鼠腰椎终板软骨干细胞分化的影响。[方法]通过胰酶、核酶及Triton X-100制备脱细胞软骨基质,将软骨基质溶于双蒸水制得脱细胞软骨基质膜。将大鼠腰椎终板软骨干细胞种植于基质膜上,CCK-8检测1、3、5 d的增殖情况,并与空白板对照。取P3代终板软骨干细胞种植于铺有软骨基质的孔板(DEPM组)和两组空白板(正常诱导组和无诱导组),然后进行成骨、成脂肪及成软骨分化诱导,2周后,茜素红、油红O及番红染色,分别鉴定其成骨、成脂肪及成软骨能力;每组取4孔按500 ul/孔加入DMSO,置于酶标仪上,在450 nm波长下检测各组的吸光度。同时Real-Time PCR分别检测成骨、成脂肪及成软骨特征性基因Runx2、Col-2a1和PPAR?在各组中的相对表达量,分析干细胞在软骨基质上的分化倾向性。[结果]大鼠腰椎终板软骨干细胞能够在脱细胞软骨基质上生长,并与其有很好的组织相容性。将终板软骨干细胞进行诱导后染色发现,DEPM组的干细胞具有更强的成骨分化能力,较低的成脂肪及成软骨分化能力。Real-Time PCR检测成骨基因Runx2在DEPM组较其他两组呈较高表达,而Col-2a1和PPAR?基因表达较低。在450 nm波长下,DEPM组中的成骨吸光度最大,大于其他两组,成脂肪及成软骨的吸光度小于正常诱导组。[结论]脱细胞软骨基质能够较好的保持干细胞成脂肪及成软骨的分化特性,但是促进干细胞向成骨方向分化。

Fibronectin差别黏附法筛选、纯化软骨终板干细胞

目的通过Fibronectin介导进行差别黏附筛选软骨终板干细胞,观察筛选的效果及其初步生物学性能。方法从脊柱融合术中获取椎间盘软骨终板标本,机械-酶消化法获取原代软骨终板细胞,体外扩增至第2代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶,孵育20 min后将未贴壁细胞及培养液转移至新培养瓶再孵育40 min,吸弃未贴壁细胞及培养液,所得2瓶细胞进行体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面标志物。对筛选后的细胞进行向多系细胞诱导分化。结果第2代细胞筛选前,细胞形态个体差异较大,呈三角形或多角形,融合时呈铺路石样外观,筛选后细胞形态比较均匀,形成细胞克隆群。流式细胞仪检测发现:经Fibronectin筛选后所获软骨终板干细胞CD90、CD73表达阳性率>95%,CD105表达阳性率>85%;经诱导能向骨、软骨及脂肪细胞方向分化。结论 Fibronectin筛选所得的软骨终板细胞基本符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义标准。Fibronectin差别黏附筛选法得够有效筛选、纯化软骨终板干细胞。

人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究

目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定。通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养)。在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)m RNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化。结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5%、98.7%、98.7%);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P<0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P<0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P<0.05)。结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子。

软骨终板干细胞外泌体活化巨噬细胞自噬抑制软骨终板炎的研究

目的探讨软骨终板干细胞外泌体通过调控巨噬细胞进而抑制软骨终板炎的机制。方法采用免疫组化检测炎症因子和巨噬细胞在不同分级分期退变的软骨终板组织中的表达和浸润,NTA(nanoparticle tracking analysis)和透射电镜鉴定外泌体,外泌体质谱检测和KEGG富集分析预测相关信号通路,Western blotting和免疫荧光检测巨噬细胞中自噬因子LC3A/B和炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的蛋白水平。结果在临床标本中,软骨终板的退变程度与巨噬细胞浸润数量IL-1β水平均正相关;40μg/ml软骨终板干细胞外泌体可有效活化巨噬细胞自噬,使P62表达降低,LC3B表达增加;自噬激动剂Rapamycin(20μmol/ml)则降低了TBHP诱导巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β的水平。结论软骨终板干细胞外泌体通过活化巨噬细胞自噬,降低其炎症因子表达,延缓了软骨终板炎的进程。

缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制

目的 :观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信号通路在其中的作用。方法 :从临床获取退变椎间盘软骨终板标本,分离培养软骨终板细胞,使用琼脂糖筛选获得CESCs并进行干细胞标志物鉴定,将第三代细胞分别在常氧/完全培养基(对照组)与缺氧和营养缺乏(实验组)条件下培养48h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活性,Western Blot检测BNIP3、Bcl-2关联x蛋白(Bax)、Bcl-2关联k蛋白(Bak)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达水平。使用BNIP3小干扰RNA(siRNA)干扰CESCs中BNIP3基因,同时设置阴性干扰对照组(Scramble siRNA),同前分组处理后再次检测细胞凋亡率、细胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达水平。结果:对5例标本获得的CESCs进行了干细胞标志物鉴定,其中细胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105为阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性,提示CESCs具有干细胞特性。实验组细胞凋亡率为(29.12±0.65)%显著高于对照组的(14.87±2.03)%(P<0.05);实验组的细胞增殖活性明显降低,为对照组的56.18%(P<0.05)。与对照组相比,实验组BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。使用BNIP3 siRNA干扰后,缺氧和营养缺乏引起的细胞凋亡增加和细胞增殖活力下降均被明显抑制;同时,缺氧和营养缺乏导致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表达升高也被显著逆转(P<0.05)。结论:缺氧和营养缺乏能够诱导CESCs发生凋亡,此过程可能是通过上调BNIP3、Bax和Bak蛋白表达而发挥作用的。

软骨终板干细胞及骨髓间充质干细胞对软骨终板细胞增殖分化的影响

背景组织工程作为一项年轻的技术获得了越来越多脊柱医学研究者的关注。但组织工程种子细胞的选择仍无明确标准。目的获取并鉴定软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cell,CESC)和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC),通过对比探明CESC是否有作为组织工程种子细胞的潜在可能。方法原代培养SD大鼠软骨终板细胞(cartilage endplate cell,CEP),甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型,通过单克隆法筛选培养CESC和BMSC;三系诱导分化验证CESC和MSC干细胞特性;取P3代CEP、CESC和BMSC进行非接触式共培养,在1 d、3 d、5 d、7 d,CCK-8检测三组Transwell小室下层CEP增殖,并绘制增殖曲线;流式细胞仪检测共培养7 d后三组下层小室CEP凋亡变化,RT-qPCR检测CEP表型基因ACAN、COLⅡ、Sox9表达变化。结果甲苯胺蓝染色显示原代培养的CEP能够分泌软骨相关的多糖物质,如糖胺聚糖等,且具有特征性多角形形态,呈铺路石样分布;通过单克隆法分离出的CESC和BMSC经三系诱导分化后,茜素红染色能够观察到被染成红色的钙结节,油红O染色观察到细胞周围出现大量类圆形红色脂滴形成,番红染色观察到软骨细胞特异性分泌的聚集蛋白聚糖出现。CCK-8检测表明CESC组和BMSC组增殖能力均强于CEP组,且CESC组增殖能力强于BMSC组,三组CEP凋亡水平无统计学差异;RT-qPCR结果表明三组CEP共培养第1-7天ACAN、COL2A1和Sox9表达均呈波峰状改变,第3天表达水平最高。第1天、第7天三组软骨表型基因表达ACAN、COL2A1和Sox9差异无统计学意义;第3天、第5天CESC组表达高于BMSC组和CEP组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CESC和BMSC通过非接触式共培养均能够增强CEP增殖和软骨表型的表达,且前者作用明显更强。

髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响

目的:探讨髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响。方法:选取13位脊柱退行性变患者,根据Pfirrmann分级标准将患者分为轻度组、中度组和重度组。取患者的椎间盘软骨终板组织分离并培养CEMSCs,培养到第3代后,检测细胞的活性、凋亡率和复苏情况。结果:轻度髓核退变组患者CEMSCs荧光强度最高,重度组最弱(P<0.05);轻度组CEMSCs凋亡最少,重度组最多,轻度组细胞活力和复苏活力最强,重度组最弱,均具有统计学意义(P<0.05)。结论:髓核退变程度影响软骨终板干细胞的活性、凋亡率和复苏情况,髓核退变程度越高,软骨终板干细胞的活力越弱,凋亡越多,复苏活力越弱。

猪脱细胞软骨基质生物相容性及细胞毒性评价系统的建立

背景:相对于其他用于支架材料的高分子化合物,脱软骨细胞基质能够模拟出更接近原生理状态下的细胞外环境,由其制备的椎间盘支架弹性模量也更加接近软骨组织。目的:制备脱细胞软骨基质,并从细胞和活体两方面评价其生物相容性。方法:将猪软骨粉碎后,经胰酶、核酶及TritonX-100处理得到脱细胞软骨基质。(1)细胞毒性实验:将脱细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜。将SD大鼠腰椎终板软骨干细胞接种于脱细胞基质膜上,培养1-5 d,采用CCK-8检测软骨干细胞在基质膜上的增殖情况,评价细胞毒性分级;(2)动物体内毒性实验:将含有脱细胞基质的醋酸(实验组)与醋酸(对照组)分别注射至SD大鼠背部皮下,形成皮丘,注射后36 h内观察大鼠体温与皮丘直径变化。结果与结论:(1)细胞毒性实验:倒置显微镜下可见,腰椎终板软骨干细胞接种于脱细胞基质膜2 d即贴壁,呈梭形生长,接种5 d内的细胞相对增殖率均在80%以上,细胞毒性分级为0至1级;(2)动物体内毒性实验:注射后即刻,两组大鼠背部均可见皮丘形成,注射36 h内皮丘内溶液被完全吸收,并且对照组吸收速度快于实验组,两组皮丘边缘均无红肿现象;注射36 h内,实验组与对照组大鼠体温均未超过37.5℃;(3)结果表明:脱细胞软骨基质具有很好的生物相容性,符合生物支架选材标准。

应力调节人椎间盘软骨终板干细胞成骨分化的研究

目的探讨周期性拉伸应力对人椎间盘软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)成骨分化的影响。方法利用琼脂糖悬浮培养系统从人退变椎间盘软骨终板中分离CESCs。取部分软骨终板组织用于免疫组织化学染色。采用Flexercell-4000TM应力加载系统对接种于培养板内的第3代CESCs分别施加1、6、12、24 h的拉伸刺激(实验组),拉伸率为10%,频率1 Hz;以同样条件接种于培养板不进行牵拉的静态培养细胞为对照组。加载完成后,Western blot检测CESCs中BMP-2蛋白的表达变化;实时荧光定量PCR检测Runx2、ALP及SOX9基因的表达变化。结果免疫组织化学染色提示BMP-2蛋白表达于软骨细胞。Western blot检测示,10%的持续周期性拉伸应力可上调CES Cs中BMP-2蛋白相对表达量,除1 h外,实验组其余各拉伸时间点BMP-2蛋白相对表达量与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并具有时间依赖性。实时荧光定量PCR检测示,周期性拉伸应力上调了Runx2和ALP m RNA表达,下调了SOX9 m RNA表达,实验组拉伸12、24 h的Runx2和ALP m RNA相对表达量及拉伸6、12、24 h的SOX9 m RNA相对表达量与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并具有时间依赖性。结论周期性拉伸应力作用于体外培养的CESCs,可通过调节部分成骨相关基因的表达诱导CESCs向成骨方向分化。

低氧对体外人软骨终板干细胞增殖、衰老、凋亡的影响

该文应用原代培养的方法获得人软骨终板干细胞(cartilage endplate derived stem cells,CESCs)。采用水溶性四唑盐(WST)-1法、Edu掺入法、β-半乳糖苷酶染色法、流式细胞术检测低氧(1%O2)刺激对CESCs细胞增殖、衰老、凋亡以及细胞周期的影响。结果显示,与常氧(21%O2)组相比较,低氧刺激对CESCs增殖活性有显著的促进作用,低氧处理72 h后,CESCs的增殖活性增加最为显著,低氧刺激能够极为显著的抑制CESCs的衰老,低氧对CESCs的凋亡同样具有极为显著的抑制作用;低氧影响CESCs的细胞周期,呈现出G1期细胞比例先增加后减少和(S+G2/M)期细胞比例先减少后增加的趋势。结果表明,低氧刺激能够促进CESCs增殖、抑制细胞衰老和凋亡。

MGF对人软骨终板干细胞增殖和迁移的影响

力生长因子(mechano growth factor,MGF)在多种组织均有表达,能促进力效应细胞的增殖和迁移。为研究MGF对人软骨终板干细胞(cartilage endplate derived stem cells,CESCs)增殖和迁移的影响,该研究采用CCK-8检测法、Transwell实验、蛋白免疫印迹法(Western blot)分别对CESCs的增殖、迁移以及Erk磷酸化表达水平进行检测。结果显示,MGF能促进CESCs的增殖和迁移,且效应具有剂量依赖性,当浓度为4.5 ng/m L时MGF促增殖和迁移的效应最大(P<0.05)。给予细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,Erk)抑制剂PD98059时,MGF促增殖效应显著下降(P<0.001);给予胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)抑制剂PQ401时,MGF促迁移效应也显著下降(P<0.001)。Western blot检测结果显示,给予MGF后,CESCs的Erk磷酸化表达水平显著升高(P<0.001),但IGF-1R抑制剂PQ401能抑制Erk磷酸化的表达(P<0.001)。该研究表明,MGF具有促CESCs增殖和迁移的效应,该效应依赖于Erk的磷酸化表达,且IGF-1R在MGF促迁移的效应中扮演重要角色。

软骨终板干细胞源性外泌体对椎间盘退变的影响

[目的]探讨大鼠软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESC)来源的外泌体对髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)以及椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)的影响。[方法]从大鼠椎间盘中提取并培养CESC和NPC。利用超速离心方法提取并纯化正常CESC分泌的外泌体(Nor-Exos)和高糖诱导衰老CESC分泌的外泌体(Eld-Exos),分别与NPC共培养。Tunel染色和流式细胞检测三组的细胞凋亡数,Western blot检测NPC中Bax,Bcl-2,Cyclin D1和Cyclin D3蛋白表达水平。9只SD大鼠随机分三组,分别为空白对照组、Nor-Exos组和Eld-Exos组,通过针刺法建立IVDD模型并给予相应处理,术后5周行MRI检查,按Pfirrmann评级标准评分。[结果]体外实验,细胞凋亡由低至高依次为空白对照组<Nor-Exos组<Eld-Exos组,总体组间差异和两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Bax的蛋白表达由低至高依次为空白对照组<Nor-Exos<Eld-Exos组,而Bcl-2、Cyclin D1和Cyclin D3蛋白相表达低至高依次为Eld-Exos组<Nor-Exos组<空白对照组,总体组间差异和两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。体内实验,Pfirrmann分级评分由低至高依次为,空白对照组<Nor-Exos组<Eld-Exos组,总体组间差异和两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]Eld-Exos显著促进NPC的凋亡,增加椎间盘组织中凋亡蛋白水平,加快IVDD的进展。

人退变椎间盘内3种干细胞的生物学特性比较

目的比较来源于同一人退变椎间盘内髓核干细胞（NPSCs）、纤维环干细胞（AFSCs）及软骨终板干细胞（CESCs）的生物学特性。方法收集7例经x线、核磁共振成像（MRI）确诊为椎间盘突出症患者，将取出的椎间盘仔细分离并进行酶消化、滤网过滤后获得NPSCs、AFSCs及CESCs。培养至第3代时，采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测3种干细胞的生长活性，并进行成脂、成骨及成软骨诱导分化。诱导2td后分别应用油红0染色检测细胞成脂能力，茜素红染色检测细胞成骨能力，甲苯胺蓝染色检测细胞成软骨能力。提取第3代细胞总RNA，分别行反转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测成脂、成骨及成软骨相关基因的表达情况。结果来自于同一患者的NPSCs、AFSCs与CESCs形态上相似，差异无统计学意义（P〉0．05）。生长曲线显示CESCs[第1、3、5、7、9、11、13、15天吸光度（A）值分别为0．35±0．01、0．52±0．02、0．64±0．08、0．80±0．19、0．79±0．20、1．06±0．11、1．37±0．09、1．31±0．41]与AFSCs（第1、3、5、7、9、11、13、15天A值分别为0．38±0．01、0．50±0．03、0．72±0．06、0．82±0．13、0．87±0．08、0．87±0．09、1．20±0．05、1．43±0．05）增殖能力要比NPSCs（第1、3、5、7、9、11、13、15天A值分别为0．32±0．02、0．42±0．04、0．59±0．01、0．64±0．17、0．65±0．19、0．68±0．21、0．67±0．12、0．59±0．12）活跃。油红0染色、茜素红染色及甲苯胺蓝染色分别证实3种干细胞均可向脂肪、骨及软骨三系诱导分化。RT—PCR检测结果显示AFSCs在成脂[过氧化物酶体增殖物激活受体1（PPA脚）：6．85±0．32，脂蛋白脂肪酶（LPL）：13．72±0．37]、及成软骨[Ⅱ型胶原（COL-2）：10．45±1．10，性别决定因子相关基因-9（SOX-9）：14．39±1．22]基因表达方面比NPSCs（PPARγ：6．63±0．50，LPL：8．41±0．42，COL-2：3．53±0．62，SOX-9：7．66±0．68）与CESCs（PPARγ：7．21±0．21，LPL：10．62±0．37；COL-2：8．26±0．49，SOX-9：13．70±1．10）略强；而成骨能力方面，CESCs最强[Runt相关转录因子2（RUNX-2）：7．30±1．1，COL-2：8．22±0．84]，AFSCs（RUNX-2：6．20±O．92，COL-2：4．94±0．90）与NPSCs相当（RUNX-2：2．61±0．06，COL-2：7．05±0．82）；NPSCs的成脂基因尤其LPL基因表达较低。结论NPSCs、AFSCs及CESCs在体外培养中细胞形态相似，但生物学特性方面存在差异。体外诱导分化及RT-PCR检测结果均提示AFSCs比其他两种干细胞在椎间盘组织工程领域中更加具有优越性。