蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测

为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉米泛素基因的启动子(pUbi)、烟草的花蕊特异性TA29的基因发育调节启动子(pTA29)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子(tE9)、章鱼碱合成酶终止子(t OCS)、谷氨酰胺转移酶7终止子(tg7)、花椰菜花叶病毒终止子(tCaMV35S))为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明:建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。

豌豆终止子rbc-T在转基因小麦研究中的应用

目前常用的转基因载体元件大多为真菌或细菌来源,引发对转基因食品安全性的担忧。本研究克隆了豌豆终止子rbc-T,并用其替换农杆菌终止子nos-T构建转化载体,利用基因枪法将携带Ubi启动子、GUS基因和终止子rbc-T组成的最小表达框片段转化普通小麦,同时以带有nos-T终止子的载体为对照,经过PCR检测筛选获得T2代稳定遗传的转基因小麦株系。GUS组织化学染色及酶活定量分析结果表明,带有nos-T及rbc-T的转基因小麦中均能检测到GUS基因不同程度的表达。因此认为,豌豆终止子rbc-T可以代替农杆菌终止子nos-T用于小麦的转基因研究。

终止子技术与生物安全

终止子技术是美国ＤｅｌｔａａｎｄＰｉｎｅＬａｎｄ种子公司和美国农业部联合申请、经美国专利局１９９８年３月批准的一项专利。整个过程可叙述为遗传工程师在转基因作物中加入了由３个基因组成的终止子基因；得到的转基因作物的种子由种子公司加上一种诱导剂；经诱导剂的作用及终止子基因间的相互作用，在种子胚胎发育的后期产生一种毒素；这种毒素杀死了发育后期的胚胎；最后得到的是成熟但不育的种子。专利获得后，引起国际上巨大反响。国际农业研究磋商小组指出，终止子技术必须禁止，不然将给全球食品保障带来影响。原因是这项技术会使农民无法留种、对遗传多样性有负影响，由于农民不再育种影响到持续农业的发展，可能出现出售或交换不能发芽的种子以及通过花粉非故意的传播造成生物安全的风险。第三世界国家认为这项技术是“种子的灾难”、“农业上的中子弹”。虽然转基因作物产生不育种子可能在解决转基因逃逸带来的生态风险上有益处，但这个收获与终止子技术可能给全球食品保障带来危机相比，两者就不能等量齐观了。从另一角度看。

两种不同终止子在转基因鲤鱼中的促生长效应

转基因构建体中启动子的选择会直接影响转植基因的活性,近年来有研究表明转基因构建体中终止子的选择会一定程度地影响转植基因的活性。为了更好地筛选转基因构建体和培育快速生长的转"全鱼"生长激素(Growth hormone,GH)基因鱼,文章用鲤鱼β-actin基因终止子和生长激素基因终止子分别构建了转基因构建体,显微注射得到转"全鱼"GH基因鱼P0代养殖群体,比较两种不同终止子构建体的活性。统计分析发现,生长激素基因终止子构建体的养殖群体的体重频率呈正态分布且平均体重显著高于β-actin基因终止子构建体的养殖群体,β-actin基因终止子构建体的养殖群体的体重频率呈右倾趋势的非正态分布。值得一提的是在混合养殖组中得到一条生长最为快速的鲤鱼证实为转基因阳性且为生长激素基因终止子构建体的转基因鲤鱼。该结果表明转"全鱼"生长激素基因鲤鱼可快速生长,并能将转植基因向下代遗传。实验结果提示生长激素基因终止子构建体比β-actin基因终止子构建体表现的促生长活性要强。

转基因大豆外源基因NOS终止子定量测定的不确定度分析

为了解转基因成分定量分析结果不确定度的主要贡献因素,提高转基因成分定量检测质量,用含转基因大豆GTS40-3-2样品进行了NOS终止子含量的测定,并对其测量不确定度进行了初步估算。NOS终止子测量不确定度估算结果:A类不确定度(u A)为0.002,B类不确定度(u B)为0.002,合成不确定度(u C)为0.003;在置信水准(P)为95%的条件下,包含因子(k)取1.96,测量结果的扩展不确定度(U)为0.016;测量结果(C)为0.032±0.016,接近约定真值(0.03),测量不确定度相对较小,检测质量较高。不确定度评估结果表明试验中的微量液体转移的偏差是测量不确定度的主要贡献者,在以后的检测中应重点注意降低微量液体转移的偏差。

转基因抗草甘膦油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源E93'终止子的检测研究

对转基因抗草甘膦油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源基因E93'终止子进行了普通PCR和Taq Man实时荧光PCR检测,建立了相应的检测方法。

转基因水稻外源基因NOS终止子定量测定的不确定度分析

为了把测试分析误差控制在允许范围内,保证测试结果有一定的精密度和准确度,使分析数据在给定的置信水平内达到要求的质量,根据JJF 1059─1999《测量不确定度评定与表示》技术规范,估算了转基因水稻外源成分NOS终止子含量测定结果的不确定度。A类评估结果为uA=0.001,B类评估结果为uB=0.008,合成不确定度为uC=0.008,置信水平为95%的扩展不确定度为U95=0.016,NOS终止子含量测量结果为0.1124±0.016。本实验测量结果不确定度分析表明,转基因水稻外源基因NOS终止子含量测定的不确定度主要来自于实验操作中的随机效应、微量移液器转移液体的误差、Ct值与lgA值的线性偏离。因此,在转基因生物安全定量分析中应重点注意上述不确定度来源对测量结果的影响。

用无终止子的RFP报告基因捕获水稻终止子研究

基因捕获技术已被广泛应用于植物功能基因组学研究。文章构建了水稻PolyA捕获载体pLJ19,该载体含有用于检测转化事件的绿色荧光蛋白报告基因(GFP)及用于进行PolyA捕获的无终止子的红色荧光蛋白报告基因(RFP),在水稻转化愈伤组织阶段筛选同时含有GFP及RFP的转化愈伤组织并进行RFP插入位点T-DNA侧翼序列(FST)分析可获得水稻终止子序列。将pLJ19转化粳稻品种‘日本晴’的胚性愈伤组织,获得了17个具有PolyA捕获事件的愈伤组织。FST序列分析表明6个T-DNA插入在水稻基因组序列中,其中有5个T-DNA插入在水稻基因3’端附近。结果表明,pLJ19载体可用于水稻终止子捕获研究中,可为水稻终止子研究提供研究方法和材料。

大肠埃希菌毒力因子ColBM质粒和转录反终止子研究进展

大肠埃希菌是临床上常见的人兽共患病的病原,其致病性是由多种毒力相关因子共同协调作用所决定的。ColBM质粒和转录反终止子(RfaH)是两个近年发现的大肠埃希菌毒力相关因子。论文对这两个大肠埃希菌毒力相关因子的研究进展进行了综述,分析其与宿主菌致病力之间的关系。

大肠杆菌内源性转录终止子的支持向量机预测方法

内源性转录终止子的计算预测是基因转录调控研究的重要内容,但当前方法的预测特异性偏低.在深入分析大肠杆菌内源性终止子中RNA发夹结构和多聚胸腺嘧啶区域等特征信号的基础上,为内源性终止子建立了一个由5个特征变量组成的包含序列组分、局部构象和能量分布信息的特征集,并根据此特征集实现了一种基于支持向量机的内源性终止子计算预测方法.针对大肠杆菌内源性终止子数据集和编码区阴性对照集的六重交叉验证测试证实了预测方法的有效性,对已知数据的预测平均正确率达到了99.4%.在对大肠杆菌全基因组限定范围内的搜索中,该预测方法可以成功地识别出绝大多数已知内源性终止子,与其他几种常用方法相比,预测结果总数大幅度减少,预测的特异性有了明显提高.

终止子的概念与结构之辨析

指出一些生物化学、分子生物学及遗传学方面高等院校教材和著作中,较为普遍存在的关于转录终止子概念与结构的描述和解释方面的错误。[编者按:发表此文,供大家参考和讨论]

链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 Ⅱ.在大肠杆菌中具有终止子活性片段的克隆和分析

在大肠杆菌的终止子探针载体pIJ667上,neo基因的正常表达可使寄主产生较强的卡那霉索抗性。然而,把链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的BclⅠ片段克隆到这个载体的BglⅡ位点,使neo的结构基因与其启动子隔开所做的克隆试验显示,有两个插入片段,BclⅠ-A和BclⅠ-E,可以有效地终止neo基因的转录,使大肠杆菌寄主对卡那霉素呈现敏感。这两个片段在pIJ101的限制性内切酶图谱上已得到了定位,其活性区域的大小分别为2.9和1.19kb。把pIJ101衍生的小质粒pIJ350上BclⅠ片段克隆到pIJ667中,不仅进一步暗示出pIJ101 BclⅠ-A片段上终止子功能的存在,而且把这个区域缩小到1.32kb的范围内。此外,这些终止子活性的表达显示出明显的方向性。

酵母终止子工程:从机理探索到人工设计

生物系统的复杂性为生物元器件的构建提出了挑战,新型控制元件的发现和稳定可调节的元件设计成为合成生物学的重要内容之一。终止子作为基因元件独立于编码基因行使终止转录的功能,是一种重要的合成生物学控制元件。研究表明终止子作用有强有弱,终止子的选择会直接影响mRNA的量,并且随着终止子结构与功能的逐渐清晰和对转录终止机理的深入解析,以短小、可控、可设计为特征的终止子工程得以快速发展。本文以常规酿酒酵母为基础,系统总结了酿酒酵母中终止子元件在结构发现、功能表征、转录终止机理方面的最新研究进展,并讨论了终止子的人工设计及在途径工程精细调控领域的应用情况,展望了终止子工程面临的挑战、可能的解决途径及在非模式酵母中发展的潜力和意义。这为研究人员开发合成生物学元件和异源合成途径优化提供了科学的理论参考。

T_(32)终止子在棒状杆菌基因表达中的功能

分别构建成两个克隆了邻苯二酚双加氧酶基因（xylE）的棒状杆菌—大肠杆菌穿梭表达质粒pJL13和pJL23.质粒pJL23中xylE基因下游带有pJL13中没有的T32终止子.比较两个质粒的邻苯二酚双加氧酶表达活性，发现T32可在棒状杆菌中有效地促进外源基因的表达.

基于卷积神经网络的细菌转录终止子预测

在遗传学中,终止子是位于poly(A)位点下游、长度在数百碱基以内、包含多个回文序列、具有终止转录功能的DNA结构域,其主要作用是使转录终止。在原核生物基因组中有两类转录终止子,即Rho⁃dependent因子和Rho⁃independent因子。在本项研究中,提出了一种新的预测模型(TermCNN)来快速准确地识别细菌转录终止子。该模型将具有代表性的6⁃mer特征子集(2537个特征)和电子—离子相互作用伪电位(EIIP)作为输入向量,利用卷积神经网络(CNN)构建预测模型。五折交叉验证和独立测试的结果表明该模型优于最新的预测模型iTerm⁃PseKNC。值得注意的是,该模型在跨物种试验中具有明显的优势。它可以高度精确地预测大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的转录终止子。

转录终止子对麦芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响

本研究使用不同的转录终止子分别构建了6种重组菌,使其通过木糖诱导实现了麦芽糖淀粉酶基因的表达。其中B.subtilis WB600(T5)菌株粗酶液活力最高,达到161.49 U/mL,单位菌体酶活相对于对照菌提高了63.9%。对6种重组菌的发酵液使用蛋白电泳分析,发现粗酶分子量大小大约为67 kDa,与理论值一致。针对生长最好的B.subtilis WB600(T1)进行简单的发酵优化,考察了培养基中不同的碳源对重组菌生长及产酶的影响,最终得出结论,当碳源为麦芽糊精时是菌体生长最好,此时B.subtilis WB600(T1)酶活力也最高为160.91 U/mL,相对于未进行优化的菌的酶活力提高了40.9%,单位蛋白酶活提高了76.8%。

枯草芽孢杆菌168新型转录终止子的构建与表征（英文）

转录终止子作为一种位于终止密码子后的调控信号,负责终止DNA的转录和RNA的释放。文中首次改造并分析了来源于噬菌体的λt_o终止子的发卡结构与富含尿嘧啶的序列对枯草芽孢杆菌168中基因转录终止效率以及mRNA稳定性的影响。结果表明,相对于野生型的λt_0终止子,突变体M3、M11和M12表现出了更高的转录终止效率,突变体M3、M4和M11更有利于上游绿色荧光蛋白mRNA的稳定。另外,我们发现插入RNase作用位点同样提高了mRNA的稳定性。研究结果表明终止子中的发卡环对转录终止不是必需的,同时,结果也证明了转录终止子可以作为一种潜在的工具用于提高枯草芽孢杆菌中mRNA的稳定性以及相应酶的表达。

基因串联策略强化枯草芽孢杆菌终止子的功能及其在基因表达中的应用

在底盘微生物中使用高性能终止子能够显著增强基因终止效率,维持新合成mRNA的稳定性,提升外源基因表达性能。而目前缺乏专一用于枯草芽孢杆菌的终止子元件,限制了复杂功能基因电路的设计。【目的】在枯草芽孢杆菌中挖掘新的高性能终止子,并进一步重新设计,丰富适用于这一底盘的高性能人工终止子。【方法】将枯草芽孢杆菌终止子和枯草芽孢杆菌噬菌体终止子分别构建至终止子检测质粒中,测定各终止子的终止效率(terminator efficiency,TE)。将不同强度单终止子按强弱、强强、弱弱组合构建串联终止子,测定不同组合体的终止性能。利用高性能串联终止子进行天冬氨酸氨基裂解酶(Asp A)和β-葡萄糖苷酸酶(Gus A)的表达功能验证,检测高性能终止子对基因表达水平的作用。【结果】经过检测,TB5终止子终止效率最强,TE为98%。含有TB5终止子的表达体系中GFP水平比对照上调2.2倍,RFP的表达水平下调27倍。双串联组合体终止子中,TH1.5b-TB5(TE=97%)和TB5-TB5(TE=98%)串联终止子可将RFP的表达水平下调30倍。而三串联终止子中,TB2-TB5-TB5组合体与相应的双组合体相比,GFP的表达水平虽无进一步提升,但RFP的表达仅有参照的1/300。最后,通过AspA和GusA的重组表达确证了串联终止子TH1.5b-TB5和TB10-TB5对基因表达水平的提升作用。【结论】高终止效率的终止子可以显著提升上游基因的表达水平,通过一定规律的基因串联能够进一步提升终止子的工作效率。这种人工再设计的终止子可方便、快捷地构建至细菌基因表达系统,实现基因表达的高效调控。

水稻GluB-4终止子的克隆与功能分析

目前转基因常用的终止子大多为细菌或真菌来源,有可能引起转基因食品安全性问题。本研究以水稻(Oryzasativa)‘kitaake’为材料,克隆了谷蛋白B-4基因(GluB-4)的终止子GluB-4-T(GenBank登记号:X14393),分析了其在不同启动子驱动下替代根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶终止子(nos-T)的可能性。β-d-葡糖醛酸酶(GUS)组织化学染色结果表明, GluB-4-T在GluB-3启动子驱动下,未改变GluB-3启动子的组织表达特异性,但GUS表达强度发生了改变; GUS活性分析显示GluB-4-T GUS活性是nos-T的2.4倍。为验证GluB-4-T增强外源基因表达的特性不依赖于上游启动子序列,将其克隆到强的胚乳特异性启动子GluC和组成型启动子OsActin下, GUS活性分别是nos-T的2.0和2.2倍,说明GluB-4-T增强外源基因表达的特性不依赖于上游启动子序列。以上结果表明GluB-4-T在水稻体内发挥正常的转录终止活性,且比nos-T表达活性强,可以作为有效终止子用于遗传转化,避免多基因转化系统中由于转基因同源性过高引起的转基因沉默现象。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异表达提供理论依据。

烟草根特异NtR19基因终止子的克隆及功能分析

为了开发具有自主知识产权的且来源于烟草的终止子,本研究根据烟草根特异NtR19基因的3'UTR序列设计引物,从烟草基因组中克隆并获得了该基因的终止子(T19),并构建植物表达载体转化翠碧一号烟草,通过分子检测和GUS染色验证了NtR19基因终止子具有转录终止的功能,同时也说明NtR19基因全长mRNA的3'UTR可以作为终止子加以利用,使用来自烟草的终止子能在一定程度上解决外源基因安全性的研究,这对转基因的安全性提供了资源基础。