PRRSV经典株和变异株RT-nPCR鉴别诊断方法的建立

【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测,达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列,设计并合成了2对引物,通过改变不同的反应体系和反应条件,建立PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测,验证建立RT-nPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL;且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带,从CH-1R经典株扩增出649bp条带,从SXXY/2013变异株扩增出562bp条带,电泳后能清晰区别,而从其他参考毒株中均不能扩增出目的条带。从48份疑似病料组织和血清中能直接检测出31份阳性结果。【结论】建立了一种灵敏度高、特异性好、可直接从病料组织和血清中快速鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR方法。

多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株基因序列,设计合成了2对引物,分别扩增NSP2和N SP 9部分基因片段,建立了一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。该方法扩增PRRSV变异株时可获得380 bp的特异性片段,扩增PRRSV经典株时则获得380 bp和680 bp两条特异性片段,根据RT-PCR产物可将两者区分开来。试验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点,是一种快速准确检测PRRSV的方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332bp(经典株)和241bp(变异株),根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。

伪狂犬病病毒变异株和经典株对小鼠致病力差异的研究

为评价伪狂犬病病毒(PRV)变异株和经典株对小鼠的致病力差异,本研究将PRV变异株(PRVTJ)和经典株(PRVSC)以103 TCID50的剂量经肌肉注射途径接种小鼠之后,通过观察小鼠的临床症状、记录小鼠的体质量变化和死亡率,利用荧光定量PCR(qPCR)检测小鼠各组织中病毒基因拷贝数,分析小鼠各组织脏器的病理学变化,系统评价PRV变异株和经典株的致病力差异。研究结果显示,接种PRVTJ和PRVSC的小鼠在临床表现上无明显差异,但接种PRVTJ的小鼠体质量下降明显,死亡率相对更高;qPCR检测结果显示,PRVTJ对小鼠的组织嗜性增强,尤其是对脑组织的嗜性增强;病理组织学分析结果显示,接种PRVTJ的小鼠脑组织的炎性病变更明显。本研究初步证实,PRVTJ对小鼠的致病力增强,且其毒力增强的主要原因是对小鼠的神经嗜性增强。本研究为PRV变异株致病力增强机制研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒经典株与变异株高分辨率熔解曲线方法的建立

为了建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典株与变异株的高分辨率溶解曲线方法,基于PEDV经典株与变异株在S基因上序列的差异设计1对PCR引物用于RT-PCR扩增,扩增产物通过高分辨率熔解曲线(HRM)分析,建立鉴别PEDV经典株与变异株的PCR-HRM分析方法。通过此方法检测了10份临床样品,PCR-HRM结果表明,4份为PEDV经典毒株,6份为PEDV变异毒株。该方法特异性好,灵敏度高,PCR后无需开盖分析,避免了污染问题,是一种新型的鉴别检测方法。

高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染的研究

应用RT-PCR技术对来自广东省某猪场患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪肺脏组织进行检测,结果初步鉴定为PRRSV高致病性变异株(YGhp株)与经典株(YGcl株)混合感染。进一步对2个毒株的NSP2基因进行序列分析,结果发现YGhp株与VR-2332、JXA1和Lelystad株的核苷酸同源性分别为75.1%、99%和35%,而YGcl株与上述毒株的同源性分别为99%、77.7%和34.5%,表明YGhp株为高致病性变异株,YGcl株为经典株,均属美洲型。高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染属非常罕见。

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株双重RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立具有高敏感性能区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株的双重RT-PCR检测方法。【方法】首先从退火温度与引物浓度先对猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病株的单项RT-PCR方法的条件分别进行筛选与优化,然后对其双重RT-PCR方法的条件进行筛选与优化,并进行特异性与敏感性检测,最后初步应用于临床样品检测。【结果】建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株双重RT-PCR检测方法不能检出猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒等当前流行较广的其他猪源RNA病毒,对猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病株的检测灵敏度分别是100、200 copies/μL。此方法对2020—2021年8个猪场的220份血清样品的检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病株的个体阳性率分别为7.73%和43.64%,与单项RT-PCR方法检测结果完全一致。【结论】建立了一种高敏感性的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和高致病株双重RT-PCR检测方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株国家核酸标准物质的研制

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）美洲经典株国家核酸标准物质,将美洲经典株代表PRRSV VR2332接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值和临床试用。结果表明制备的标准物质的定值为（2. 06±0. 31）×104copies/μL;样品均匀;-20℃稳定保存12个月以上、4℃稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的PRRSV美洲经典株核酸标准物质。

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR GreenⅠ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性。应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、142、1 d分别采集全血,检测结果均为阳性。证实,本试验所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株。

猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。

兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR鉴定

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株(RHDV)和变异毒株(RHDV2)的RT-PCR检测方法。根据Gen Bank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计2对分别结合两种基因的特异性引物。利用2对引物,以人工合成RHDV2的VP60基因构建的p MD19-T-VP60-2和p MD19-T-VP60为模板,进行RT-PCR体系退火温度的优化,优化后的退火温度为58.2℃。对优化后的RT-PCR体系进行RHDV和RHDV2的敏感性试验、特异性试验,并用于检测RHDV人工感染样品和疑似临床样品,结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,经典RHDV和RHDV2的检测限度分别为95拷贝和76拷贝的靶基因片段,且对支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病原以及重组质粒p MD19-T-EBHSV的检测结果均为阴性。RHDV人工感染的组织样品检出率为100%,15份临床样品中3份为经典RHDV阳性,其他均为经典RHDV及RHDV2阴性。该方法的建立能够实现快速、特异及敏感地检测RHDV和RHDV2,为监测RHDV变异株的流行情况提供技术支撑。

三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT-PCR、直接免疫荧光(direct immunofluorescence asay,DFA)及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT-PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT-PCR的总符合率分别为92%和85.5%。RT-PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。

建立快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株RT-PCR方法的研究

为了快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,试验通过建立的RT-PCR方法获得电泳条带大小不同的PCR产物,以此区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,并用RT-PCR方法检测实验室保存的12份临床阳性样品。结果表明：可以通过RT-PCR方法区分经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株,并且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等猪常见病毒无交叉反应;临床样品检测试验显示,1份为经典毒株、5份为高致病性毒株、5份为天津疫苗株,与测序结果相符。说明试验成功建立了同时区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株的RT-PCR方法,且特异性强、灵敏度较高、重复性好、操作简单。

猪伪狂犬病病毒灭活疫苗对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株的免疫保护效果评估

为评估猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)和PRV活疫苗(Bartha-K61),免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28天采血测定PRV gB抗体,并分别使用PRV流行毒株HN1201株和经典毒株闽A株测定免疫后第0、7、14、21和28天血清的中和抗体水平,于免疫后第28天分别使用HN1201株和闽A株攻毒并观察,之后测定体温,测定攻毒后第7和14天PRV gE抗体,及攻毒后0~8 d的排毒情况。结果显示,HN1201-ΔgE免疫组较Bartha-K61免疫组gB抗体和中和抗体产生早,且抗体水平较高。两个免疫组试验猪在攻毒后虽然均无明显临床症状,且免疫组织化学检测(IHC)组织中的病毒抗原均为阴性,但HN1201-ΔgE免疫组试验猪脏器未见任何病理损伤,Bartha-K61免疫组试验猪部分脏器具有病理损伤。与未免疫对照组相比,2个免疫组试验猪在HN1201株和闽A株攻毒后,gE抗体转阳时间晚且排毒率低,HN1201-ΔgE免疫组gE抗体水平整体均低于Bartha-K61免疫组,攻毒后排毒检测中,Bartha-K61免疫组于2个毒株攻毒后第3~5天可检测到排毒,而HN1201-ΔgE免疫组全程未检测到排毒。研究结果表明,灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)对PRV流行毒株和经典毒株均可提供完全保护。

多毒株蓝耳病混合感染的防控案例

本文报告了某猪场保育猪蓝耳病经典毒株、高致病性毒株和类NADC30毒株混合感染的防控案例。采用种猪群和断奶仔猪同时加药保健、种猪群和商品猪同时使用蓝立优和蓝净优组合免疫、加强生物安全措施和饲养管理等综合防控方案半年后,猪群稳定。表明蓝立优免疫后不仅可以抵抗蓝耳病经典毒株和高致病性毒株的感染,还可以抵抗类NADC30毒株的侵害。

Bartha-K61疫苗对PRV变异株免疫效果的Meta分析

为了给预防与控制伪狂犬病(PR)提供科学参考,本试验采用Meta分析的方法对已发表的Bartha-K61疫苗对伪狂犬病病毒(PRV)变异株免疫效果进行评估。首先通过计算机建立检索式检索中国知网、万方、维普和PubMed数据库,收集对照试验;然后采用RevMan 5.4.1软件以攻毒保护率为结局指标进行Meta分析;共纳入15篇文献,190头仔猪,试验组105头,对照组85头,试验组均采用接种Bartha-K61疫苗+攻毒PRV变异株的干预方式,对照组有3种干预方式,分别为接种Bartha-K61疫苗+攻毒PRV经典株、不接种PRV疫苗+攻毒PRV变异株、接种其他PRV疫苗+攻毒PRV变异株,其中只有不接种PRV疫苗+攻毒PRV变异株对照组的数据有统计学意义。结果显示:各研究间同质(P=0.91>0.1,I~2=0<50%),研究结果稳定性较好,Bartha-K61疫苗对PRV变异株的攻击可以提供免疫保护(合并OR=22.77,95%CI=9.91~52.28)。综合分析15篇单个试验研究的结果表明,经典疫苗Bartha-K61对PRV变异株的免疫保护达到80%以上,且高滴度的疫苗效果更好,但比起其对经典株的保护效果略差;而且,以PRV变异株为亲本研制的疫苗对亲本毒株的攻毒保护效果优于Bartha-K61疫苗。

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为了建立与应用一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株的方法,试验采用特异性试验、敏感性试验、临床应用等方法对鉴别诊断PEDV变异毒株的一步法双重RT-PCR方法进行了研究。结果表明：该方法对PEDV变异毒株能扩增出大小为870 bp和543 bp的二条特异性条带,对PEDV经典毒株和疫苗株均只能扩增出大小为543 bp的一条特异性条带;对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（RV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）均无任何扩增条带;对变异毒株、经典毒株、疫苗株的检测灵敏度分别达0.75 ng、0.80 ng、0.09 ng的RNA含量;用该方法检测136份猪腹泻病料样品,共检测出阳性样品72份,其中变异毒株阳性样品65份,变异毒株阳性率达47.79%,与基于S基因单重RT-PCR方法和基于ORF3基因单重RT-PCR方法的符合率均为100%。说明该一步法双重RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性和敏感性,操作简单,可以准确、快速鉴别诊断出PEDV变异毒株。

PRRSV经典毒株、高致病毒株、类NADC30毒株及类NADC34毒株鉴别RT-PCR检测方法的建立及应用

为提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)不同流行毒株的快速鉴别诊断能力,本研究对近几年国内外流行的PRRSV不同毒株的Nsp2核苷酸序列进行比对,设计了1对可用于鉴别4类不同PRRSV毒株的简并引物,建立了鉴别PRRSV经典毒株(C-PRRSV)、高致病毒株(HP-PRRSV)、类NADC30毒株(NADC30-like)及类NADC34毒株(NADC34-like)的RT-PCR检测方法。结果显示,C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、NADC34-like毒株Nsp2基因的扩增片段大小分别为1072 bp、982 bp、679 bp、772 bp,检测限分别为4.70×10 copies/μL、3.34×10^(2)copies/μL、8.57×10 copies/μL、5.71×10^(2)copies/μL,对其他常见猪病病原均未扩增出特异性条带,3次重复试验均能够扩增出均匀一致的目的片段;83份临床组织样品共检出阳性27份,其中NADC30-like毒株7份、NADC34-like毒株20份,与GP5基因检测结果的符合率为97.6%。上述结果表明,本研究建立的PRRSV鉴别RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、NADC34-like毒株的快速鉴别和流行病学调查。

猪流行性腹泻流行趋势与防控

近些年我国猪群持续发生猪流行性腹泻病,虽然该病没有呈现广泛流行趋势,但是由于该病毒变异毒株广泛存在,所以猪流行性腹泻在我国主要呈现地方流行或散发,而且有明显的季节性,秋冬季节是该病的高发季节。猪流行性腹泻病毒最早流行是在1971年的英国,在1980年左右亚洲很多国家开始流行,我国在1989年开始发生猪流行性腹泻,且以经典毒株为主,而在2006年我国出现了猪流行性腹泻病毒变异毒株,在2010年我国再次流行猪流行性腹泻病毒变异毒株,导致我国再次暴发猪流行性腹泻,发病率和死亡率达到100%,对我国猪养殖业发展造成了严重的影响。