单增李斯特菌感染人绒毛膜滋养层细胞比较蛋白质组学研究

目的分析单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)感染人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo过程中引起的细胞蛋白质组变化。从宿主细胞分子水平对单增李斯特菌感染胎盘的机制进行研究。方法运用TMT(Tandem Mass Tags)蛋白质组学技术对HTR-8/Svneo感染组和非感染组蛋白质组进行定量分析,运用GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异表达蛋白进行分子功能、生物过程及代谢途径富集分析。结果共鉴定肽段76285个,可定量蛋白6979个。HTR-8/Svneo感染过程中356个蛋白发生了显著性差异表达。153个表达量上调,203个表达量下调。差异表达量倍数最高的蛋白为微管马达蛋白(B4DYE2),最低为翻译起始因子1(Q6IAV3)。GO功能富集和KEGG代谢途径富集结果表明,上调蛋白参与的生物过程和代谢途径集中在微管、微丝运动,细胞自噬等方面,下调蛋白集中在碳代谢、氮代谢、氨基酸生物合成、核酸代谢等初级代谢途径和泛素介导的蛋白质水解等方面。结论单增李斯特菌侵袭HTR-8/Svneo过程中,宿主细胞的基础代谢可能发生了显著降低,并处于较高的自噬水平。细胞迁移诱导透明质酸酶CEMIP(Q8WUJ3)的显著上调说明该蛋白可能在调节滋养层细胞迁移、侵袭能力进而造成不良妊娠方面具有重要作用,为单增李斯特菌感染胎盘分子机制研究提供新的思路。

黄芪甲苷对高糖诱导人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)焦亡及侵袭迁移的影响

【目的】探讨黄芪甲苷对高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)焦亡及侵袭迁移的影响。【方法】将HTR-8/SVneo细胞分为4组:对照组(未处理)、高糖组(高糖刺激)及黄芪甲苷50、100μmol/L组(高糖刺激+黄芪甲苷)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力,分别采用Transwell实验和划痕实验测定细胞侵袭、迁移能力,Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)双荧光染色评估细胞焦亡情况,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶剪切体(cleaved-Caspase-1)、消皮素D-N端(GSDMD-NT)、白细胞介素18(IL-18)蛋白表达水平。【结果】与对照组比较,高糖组HTR-8/SVneo细胞活力显著降低,细胞迁移率显著降低,侵袭细胞数显著减少,PI阳性细胞比例显著增加,NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-NT、IL-18蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);与高糖组比较,黄芪甲苷处理组细胞活力显著升高,细胞迁移率显著增加,侵袭细胞数显著增加,PI阳性细胞比例显著下降,NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-NT、IL-18蛋白表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01)。【结论】黄芪甲苷可抑制高糖诱导的HTR-8/SVneo细胞焦亡,改善细胞侵袭及迁移能力。

SHP-2对人绒毛膜滋养层细胞增殖、侵袭、迁移和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响

目的探讨Src同源物2磷酸酶2(SHP-2)对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo增殖、侵袭、迁移和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响。方法用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SHP-2在子痫前期(PE)组胎盘组织中的表达水平。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、克隆形成实验、划痕闭合和Transwell分析检测敲低或过表达SHP-2对人绒毛膜滋养细胞(HTR-8/SVneo)增殖、集落形成、迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测侵袭相关蛋白的表达和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。结果HP-2在PE组胚胎组织中低表达。敲低SHP-2显著抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖、集落形成、侵袭和迁移,此外,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达显著下调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达显著上调,PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低,然而,过表达SHP-2具有相反的效果。结论SHP-2在PE胎盘组织中低表达,SHP-2过表达可促进滋养层细胞的增殖、侵袭和迁移能力,提示SHP-2可能是临床治疗PE的潜在靶点。

miR-30c-5p对人绒毛滋养层细胞线粒体自噬、间充质转化及PEG10水平影响

目的探讨miR-30c-5p对人绒毛滋养层细胞线粒体自噬、间充质转化及PEG10水平影响。方法人绒毛滋养层细胞HTR-8/SVneo分为空白组(HTR-8/SVneo细胞正常培养)、低氧组(HTR-8/SVneo细胞低氧培养)、miR-30c-5p mimics组(HTR-8/SVneo细胞低氧培养转染miR-30c-5p mimics)、NC-mimics组(HTR-8/SVneo细胞低氧培养转染NC-mimics)、miR-30c-5p inhibitor组(HTR-8/SVneo细胞低氧培养转染miR-30c-5p inhibitor)、NC-inhibitor组(HTR-8/SVneo细胞低氧培养转染NC-inhibitor)。qRT-PCR检测各组细胞miR-30c-5p表达;Transwell小室检测细胞侵袭数目;划痕试剂盒检测细胞划痕愈合率;相关试剂盒检测ROS水平;免疫印记检测PEG10、Parkin、PINK1蛋白水平。结果空白组、低氧组、miR-30c-5p mimics组、NC-mimics组、miR-30c-5p inhibitor组及NC-inhibitor组的miR-30c-5p表达分别为1.00±0.00、1.00±0.00、1.61±0.15、1.03±0.13、0.75±0.08及0.96±0.10,差异有统计学意义(F=45.750,P<0.05);与空白组相比,低氧组HTR-8/SVneo细胞侵袭数目、划痕愈合率、PEG10、Parkin、PINK1降低,ROS升高,差异均有统计学意义(P<0.05);低氧组与NC-mimics组、NC-inhibitor组比较上述指标,差异均无统计学意义(P>0.05);与低氧组相比,miR-30c-5p mimics组细胞侵袭数目、划痕愈合率、PEG10、Parkin、PINK1降低,ROS升高,差异均有统计学意义(P<0.05),miR-30c-5p inhibitor组细胞侵袭数目、划痕愈合率、PEG10、Parkin、PINK1升高,ROS降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抑制miR-30c-5p可加快低氧状态下的人绒毛滋养层细胞侵袭及迁移,并通过促进线粒体自噬降低ROS表达,机制与抑制PEG10水平相关。

采用miR-148a低表达人绒毛膜滋养细胞构建的子痫前期模型细胞活力、焦亡、炎性和氧化应激反应观察

目的观察采用微小RNA-148a(miR-148a)低表达人绒毛膜滋养细胞系HTR-8/SVneo构建的子痫前期(Preeclampsia,PE)模型细胞的细胞活力、焦亡、炎症和氧化应激反应。方法取对数生长期人绒毛膜滋养细胞系HTR-8/SVneo,分为甲、乙、丙、丁组:甲组细胞用抑制miR-148a表达的miR-148a inhibitor转染24 h,加入100 ng/L的LPS培养24 h(建立PE模型);乙组细胞用空白对照NC-inhibitor转染24 h,加入100 ng/L的LPS培养24 h;丙组加入100 ng/L的LPS培养24 h;丁组不做任何处理。培养48 h时,采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-148a,采用CCK8法检测各组细胞活力,采用TUNEL法测算各组细胞焦亡率,采用Western Blotting法检测各组细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD,采用ELISA法检测各组上清液炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6]及氧化应激指标[谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]。结果与丁组相比,丙组细胞miR-148a相对表达量高,培养24、48、72 h时OD值低,细胞焦亡率高,细胞Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量高(P均<0.05);与乙组相比,甲组细胞miR-148a相对表达量低,培养24、48、72 h时OD值高,细胞焦亡率低,细胞Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白相对表达量低(P均<0.05)。与丁组相比,丙组细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平高,细胞GSH和SOD表达降低、MDA表达升高(P均<0.05);与乙组相比,甲组细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平低,细胞GSH和SOD表达升高、MDA表达降低(P均<0.05)。结论miR-148a低表达HTR-8/SVneo细胞构建的PE模型细胞活力高,细胞焦亡程度、炎性反应及氧化应激反应低。miR-148a可能是PE的治疗靶点之一。

米非司酮对早孕绒毛滋养层细胞Bcl-2和caspase-3表达的影响

目的 :探讨米非司酮对人早孕绒毛滋养细胞中Bcl 2和cas pase 3表达的影响及其在滋养细胞凋亡中的作用。方法 :将10 5例自愿要求终止妊娠的早孕妇女随机分成两组 ,即米非司酮流产组 (5 5例 )及人工流产组 (5 0例 )。采用免疫组化染色方法检测早孕妇女的绒毛组织中Bcl 2和caspase 3的表达。结果 :米非司酮组与人流组绒毛滋养细胞中Bcl 2的表达率分别为 5 4 .6 %和 88.0 % ;caspase 3的表达率分别为 89.1%和 4 2 .0 %。米非司酮组与人流组相比较绒毛滋养层细胞Bcl 2呈低表达(P <0 .0 1) ,caspase 3呈高表达 (P <0 .0 1)。结论 :Bcl 2和caspase

人早孕绒毛滋养层细胞原代培养:差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性

背景:国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的体外培养方法,大多步骤繁琐,细胞纯度低而且成本很高,不适于普通实验室推广应用。目的:拟求建立一种人妊娠5～10周绒毛滋养层细胞简便有效的分离培养及鉴定方法。方法:采用改进的胰酶消化法分离培养妊娠5～10周人绒毛滋养层细胞,加0.0625%胰酶,37℃消化25～40min;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞,倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学方法鉴定细胞来源和纯度。结果与结论:倒置显微镜下原代培养滋养层细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在,1h后可见部分细胞贴壁,24h后70%～80%细胞贴壁,五六天细胞数量明显增多,细胞呈三角形、多边形平铺片状生长,核大卵圆形居中,部分细胞连接成片,部分细胞呈长梭形。七八天长满瓶壁的80%～90%可传代。9～10d铺满培养瓶底部。细胞碎屑不贴壁。传代接种后1.5h贴壁,迅速增长,三四天爬满瓶底,各代细胞形态基本一致。可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达70%～80%。采用低浓度胰酶进行长时间消化分离培养人早孕绒毛滋养层细胞,利用差异贴壁法和消化排除法以及反复换液法进行纯化,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞。

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养，胰蛋白酶消化法行传代培养，免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时，细胞开始由组织块边缘向外生长；１５ｄ时，即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。

人早孕期蜕膜和绒毛外滋养层细胞的免疫组织化学研究

侵入蜕膜组织的绒毛外滋养层细胞在HE染色标本上不易辨认。我们用免疫组织化学,ABC法,过氧化物-抗过氧化物酶标记蜕膜组织中的hCG与hPL阳性细胞。结果证明,子宫内膜中只要有一个绒毛外滋养层细胞存在就能被显示出来。这对提高妊娠诊断,防止残留滋养层细胞的增生与恶性病变很有意义。我们在蜕膜组织中还发现3类胎盘激素阳性细胞:hCG阳性细胞,hPL阳性细胞及hCG与hPL均为阳性的细胞。这一发现,证明了蜕膜有内分泌功能。

低分子肝素对不同氧浓度下早孕绒毛滋养层细胞侵袭力的影响作用

目的:研究低分子肝素(LMWH)对不同氧浓度下早孕绒毛滋养层细胞侵袭力的影响。方法:取妊娠8~10周正常绒毛组织,酶消化法分离人早孕绒毛滋养层细胞,分别置2%和20%O_2分压的细胞培养箱培养。用不同浓度LMWH(0、0.1、5、10IU/ml)处理滋养细胞,观察滋养层细胞侵袭力的改变,检测细胞中HIF-1α、MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3表达。结果:低氧浓度下,早孕绒毛滋养层细胞的侵袭能力随着LMWH浓度(0,0.1,5IU/ml)升高而增强,但高浓度的LMWH(10IU/ml)对其有抑制作用;随着LMWH浓度增加,HIF-1α和MMP-2表达呈先上升后下降的趋势;TIMP-2、TIMP-3表达改变的趋势与MMP-2相同。正常氧浓度下的滋养层细胞,其侵袭能力未见显著增强,各细胞因子的表达无上调。结论:低氧环境下,一定浓度的LMWH可提高早孕绒毛滋养层细胞的侵袭能力,其发生机制可能是通过诱导、增强滋养层细胞HIF-1α和MMP-2基因表达。

人胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养(英文)

目的 建立纯度较高的适于试验研究的人绒毛膜滋养层细胞 .方法 胰蛋白酶 - DNase联合消化法培养人绒毛膜滋养层细胞 ,间接免疫染色进行细胞鉴定 ,透射电镜观察细胞内部结构 .结果 倒置显微镜下 ,可见细胞呈不规则多角形 ,核大卵圆形 ,胞质透明 ,呈片状铺展生长 .角蛋白染色阳性率超过 95 % ,未检测到波型蛋白阳性细胞 ,表明不含污染细胞 .透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构 .结论 该法简便易行 。

enJSRV囊膜蛋白及其受体的瞬时表达与绵羊绒毛膜滋养层细胞融合的诱导研究

旨在深入研究内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白在绵羊胎盘形成过程中的作用,本研究体外培养了蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞,采用RT-PCR技术扩增出enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因全长序列,定向克隆于真核表达载体pEGFP-C1上。优化绒毛膜滋养层细胞电转染条件和测定电转效率。将构建好的真核表达质粒分别电转染到绒毛膜滋养层细胞中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。并研究高表达enJSRV-env基因及通过RNA干扰沉默enJSRV-env基因对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合活性的影响。结果显示,真核表达质粒构建成功,分别命名为pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究表明,绵羊绒毛膜滋养层细胞最佳电转染条件为脉冲电压150 V,脉冲时间5.0 ms,电击2次,间隔50 ms。转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒及pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2共转染的绵羊绒毛膜滋养层细胞中多核细胞数目明显增加,平均每个视野分别可以观察到1.8和2.3个多核细胞。说明enJSRV-env对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合有一定的促进作用。本研究为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能及绒毛膜滋养层细胞融合机理提供试验基础。

HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的初步研究

目的检测HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的情况,为HBV宫内传播机制研究提供理论依据。方法用胰蛋白酶(0.25%)-DNase Ⅰ(0.15 U/ml)联合消化法,获取纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞。将状态良好的对数生长期人绒毛膜滋养层细胞分为6组,HBsAg-anti-HBs 复合物组(Ⅰ),热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清和高滴度anti-HBs阳性血清共同孵育物组(Ⅱ), 热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清组(Ⅲ),HBsAg组(Ⅳ),热灭活的正常人血清组(Ⅴ),及正常细胞培养液组(Ⅵ,空白对照组)。分别收集各组细胞铺片,免疫组化检测细胞的感染状况。结果所获人绒毛膜滋养层细胞纯度较高,符合后续实验要求。用鼠抗人anti-HBs免疫组化检测收集的细胞铺片,发现Ⅰ、Ⅱ组均有大量HBsAg阳性信号,Ⅲ组细胞亦有少量HBsAg阳性信号出现,其他各组细胞均未发现HBsAg阳性信号。结论体外培养的人胎盘滋养层细胞能将HBsAg-抗HBs复合物中的HBsAg,但不能将单独的HBsAg“摄入”胞内。

枸杞多糖对体外培养的人绒毛膜滋养层细胞影响的研究

通过组织培养法,观察对照组及100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml LBP组中滋养层细胞的生长。通过观察各组HCG阳性细胞数及测定培养液中HCG分泌量的变化,探讨LBP对滋养层细胞分化的作用。结果:LBP组滋养层细胞均生长旺盛,HCG阳性细胞数明显多于对照组(P<0.01)。在无血清培养条件下,各组HCG分泌量无显著性差异,而有血清培养条件下,LBP组HCG分泌量分别为0.43,0.34和0.42Iμ/ml/10mg组织,几乎是对照组的2倍,(对照组仅为0.22Iμ/ml/10mg组织)。结论:LBP对体外培养的滋养层细胞具有营养和保护作用,而不是诱导分化。

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。

人绒毛膜滋养层细胞的培养

取妊娠 ６～１０周的人妊娠早期绒毛膜，用胰酶／ＤＮＡ酶消化，换瓶纯化处理，经光镜和电镜检测证实，我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。

胰岛素样生长因子系统在人早孕绒毛滋养层细胞中的表达

目的 探讨胰岛素样生长因子系统 (IGFs)在体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中的基因表达及其作用。方法 采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术半定量检测体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中IGFs m RNA的表达。结果 体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞中可以检测出 IGF- m RNA、IGF- R m RNA、IGFBP- 3m RNA的表达。结论 IGFs可能在早期细胞滋养层的侵入、增殖分化、胎盘形成和胚胎生长发育过程中以自分泌和

AQP8在正常人绒毛滋养层细胞与绒癌JAR细胞株中的表达

目的:探讨AQP8在正常人绒毛滋养细胞和绒癌JAR细胞株中的表达差异,及其表达改变与绒癌发生的关系。方法:正常人绒毛滋养细胞(正常组)的原代培养、纯化及鉴定;人绒癌JAR细胞株(绒癌组)的培养。以免疫组织化学法、免疫荧光激光共聚焦和RT-PCR技术检测AQP8蛋白和AQP8 mRNA在正常人绒毛滋养细胞和绒癌JAR细胞株细胞膜上的表达。结果:(1)应用免疫组化方法,在正常组中,仅能从显微镜中肉眼看到AQP8的极低表达,摄影效果不佳,而在绒癌组中AQP8的阳性细胞率为93.27%±14.45%,远高于正常组。(2)应用免疫荧光染色后行激光共聚焦成像技术发现,在相同的条件及激发强度下,可见AQP8在绒癌组呈绿色阳性表达,而在正常组中未见绿光,但当加强激发强度后,仍可探及AQP8在正常组的表达。(3)应用RT-PCR技术,在正常组与绒癌组中,均检测到AQP8 mRNA的表达。绒癌组AQP8的OD值(0.98±0.35)明显高于正常组AQP8的OD值(0.32±0.04)(P<0.05)。结论:AQP8表达异常上调,滋养细胞内、外水、电解质平衡将被破坏,可能是导致绒癌发生的原因之一。

糖皮质激素对人绒毛膜滋养层细胞11β-HSD1的调节

目的 :研究糖皮质激素对 1 1 β 羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型 (1 1 β hydroxysteroiddehydrogenasetype 1 ,1 1 β HSD1 )还原酶活性和mRNA表达的调节。方法 :利用原代培养的人类绒毛膜滋养层细胞 ,运用免疫细胞化学染色方法、放射性酶活性测定及Northern印迹杂交技术 ,结合图像分析技术检测 1 1 β HSD1mRNA的表达量。 结果 :1 1 β HSD1和糖皮质激素受体 (glucocorticoidreceptor,GR)免疫活性样物质共存于原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中 ,人工合成的糖皮质激素———地塞米松对绒毛膜滋养层细胞 1 1 β HSD1还原酶活性和mRNA表达具有诱导作用 ,此诱导作用可以被GR阻断剂RU486所阻断。结论 :糖皮质激素与GR结合后上调绒毛膜滋养层细胞 1 1 β

人早孕绒毛滋养层细胞的体外分离与培养

目的建立人早孕绒毛滋养层细胞有效的分离、培养方法。方法利用成纤维细胞较滋养细胞贴壁早的特性,将滋养细胞与前者分离、纯化、培养。倒置显微镜观察滋养细胞的形态学特征;免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度。结果倒置显微镜下可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达80%-85%,台盼蓝排斥试验示活细胞率超过90%。结论采用差异贴壁法及体外培养条件,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养细胞。