人早孕期绒毛和绒毛外细胞滋养细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立人早孕期绒毛细胞滋养细胞(villous cytotrophoblasts,VCT)及绒毛外细胞滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts,EVCT)的分离、培养方法。 方法:利用不同的胰酶消化条件,收集人早孕期绒毛组织的VCT及EVCT并分别培养。倒置显微镜、扫描电镜观察VCT及EVCT的形态学特征;免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度。 结果:胰酶短期、温和消化获得的EVCT,可生长于Matrigel包被的培养器皿上,并表达特异性标志物c-crbB-2;延长消化时间、增加胰酶浓度获得的VCT,种植于塑料或玻璃培养器皿上可聚集并融合形成合体滋养细胞。VCT不表达c-crbB-2。结论:采用不同的胰酶消化及体外培养条件,可简单、快捷地分别获得高纯度人早孕期VCT及EVCT。

CXCL12/CXCR4在绒毛外滋养细胞中的表达及其意义

目的:研究趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblasts,EVTs)中的表达及其在妊娠中的作用。方法:取妊娠早期绒毛,培养绒毛外滋养细胞,用免疫细胞化学技术检测其中CXCR4与CXCL12的表达;并通过体外侵袭实验,分析绒毛外滋养细胞在CXCL12作用下的侵袭能力。结果:在EVTs的胞膜和胞浆中均检测到CXCL12和CXCR4的表达;EVTs在CXCL12作用下的侵袭能力在一定范围内与CXCL12浓度呈正相关(r=0.79,P<0.01),当CXCL12浓度达到10ng/ml时最强,达到100ng/ml时则开始下降。最大趋化指数为1.71±0.14。结论:CXCL12/CXCR4受体配体系统参与绒毛外滋养细胞的侵蚀,在妊娠过程中有重要意义。

早期自然流产绒毛外滋养细胞VEGF的表达及意义

在妊娠早期,滋养细胞发育和分化为构成绒毛的滋养细胞（合体滋养细胞和细胞滋养细胞）及绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast,EVT）。EVT增殖侵入蜕膜组织,具有类似肿瘤的增殖浸润能力[1]。其中,浸入子宫蜕膜间质甚至浅肌层的称绒毛外中间滋养细胞（interstitial extravillous trophoblast,IET）,侵入母体血管的绒毛外滋养细胞称为血管滋养细胞（endovascular extravillous trophoblast, ET） 。

重度子痫前期患者胎盘绒毛外滋养细胞VCAM-1、E-selectin的表达及意义

目的探讨子宫胎盘界面绒毛外滋养细胞(EVCT)上血管细胞粘附分子(VCAM-1)及E-选择素(E-selectin)的表达特点以及与妊娠期高血压疾病的关系。方法采用免疫组织化学法观察20例重度子痫前期胎盘(妊高征组)以及孕周相配的20例正常妊娠胎盘(对照组)子宫胎盘界面蜕膜中绒毛外滋养细胞VCAM-1、E-selectin的表达;光镜下计算EVCT阳性染色强度,并用医学图象分析软件测定EVCT阳性染色的平均光密度值(MOD)。结果与正常对照比较,子痫前期患者子宫胎盘界面EVCT上VCAM-1、E-selectin的染色强度及MOD值均降低,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。结论子痫前期子宫胎盘界面EVCT上血管内皮细胞特性的粘附分子VCAM-1、E-selectin的表达减少,可能引起滋养细胞对子宫壁和血管的浸润性降低,导致子宫胎盘血管形成障碍。

TIMP-1对绒毛外滋养细胞侵袭迁移和分泌VEGF水平影响研究

目的:研究基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)对绒毛外滋养细胞侵袭、迁移和分泌血管内皮生长因子(VEGF)水平的影响。方法:缺氧复氧处理绒毛外滋养细胞HTR8/SVneo,以荧光定量PCR和Western blot方法检测细胞内TIMP-1的表达变化。在HTR8/SVneo细胞中转染TIMP-1siRNA,经缺氧复氧处理以后,以荧光定量PCR和Western blot方法检测细胞内TIMP-1的表达变化。Transwell小室检测敲低TIMP-1对缺氧复氧HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的影响,Western blot法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白水平,ELISA法检测培养液上清中VEGF、可溶性fms样酪氨酸激酶1(s Flt-1)、可溶性内皮因子(s Eng)含量。结果:缺氧复氧处理后的HTR8/SVneo细胞中TIMP-1mRNA和蛋白水平均高于未经缺氧复氧处理的细胞(P<0.05)。在细胞中转染TIMP-1 siRNA可以降低缺氧复氧细胞中TIMP-1的表达。缺氧复氧处理后的HTR8/SVneo细胞侵袭和迁移能力下降,细胞中MMP-9蛋白水平降低,细胞分泌的VEGF减少,s Flt-1、s Eng增多,与未经缺氧复氧处理的细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。下调TIMP-1可以促进缺氧复氧条件下HTR8/SVneo细胞侵袭和迁移,促进细胞中MMP-9的表达,诱导细胞分泌VEGF,减少细胞分泌s Flt-1、s Eng。结论:下调TIMP-1促进缺氧复氧条件下绒毛外滋养细胞侵袭和迁移,促进细胞分泌VEGF。

早期自然流产患者底蜕膜绒毛外滋养细胞中IGFBP7、VEGF的表达变化及意义

目的观察早期自然流产患者底蜕膜绒毛外滋养细胞(EVT)中胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化,并探讨其意义。方法早期自然流产患者20例(观察组),人工流产患者20例(对照组),采用免疫组化法检测两组患者EVT中IGFBP7、VEGF。结果观察组及对照组IGFBP7免疫染色评分(IRS)分别为(10.75±1.28)、(8.63±1.06)分,VEGF IRS分别为(5.25±1.98)、(7.75±2.25)分,两组比较,P均<0.05。Pearson相关分析显示,观察组IGFBP7、VEGF表达无相关性(r=-0.32,P=0.44)。结论早期自然流产患者EVT中IGFBP7表达升高,VEGF表达降低,两指标表达异常可能与早期自然流产的发生有关。

流式细胞仪分离人早孕绒毛外滋养细胞及鉴定

目的用流式细胞仪分离早期绒毛外滋养细胞,以便对其功能进行进一步研究。方法用胰蛋白酶消化法得到早期绒毛细胞,用流式细胞仪分离纯化绒毛外滋养细胞。所得的细胞用免疫细胞化学,光镜,透射电镜检以及W esten-b lot方法鉴定。结果使用流式细胞仪成功的分离了绒毛外滋养细胞,纯度超过98%。结论此方法可快速准确大量获得绒毛外滋养细胞。

绒毛外滋养层细胞的功能及其内分泌调节机制

妊娠是一个复杂而精细的过程。在妊娠早期囊胚着床之后，胎盘绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblast，EVT）向子宫蜕膜层和肌层血管进一步侵袭、迁移、分化，启动并完成血管重塑，是建立母．胎循环的关键环节。因此EVT细胞的迁移和侵袭功能是保证血管重塑和妊娠顺利完成的基本要素。而EVT细胞的增值、迁移和侵袭功能受到体内微环境因素，如胎盘细胞分泌的人绒毛膜促性腺激素、孕酮、雌二醇和瘦素等的精细调节。EVT细胞侵袭性迁移不足，可导致子宫螺旋动脉重塑不足，与流产、先兆子痫等妊娠相关疾病密切相关。因此，明确EVT细胞侵袭性迁移的调节机制将为预防与治疗上述疾病提供莺要依据。本文就EVT细胞的功能及其内分泌调节机制加以综林。

孕激素对绒毛外滋养细胞VEGF表达的影响

目的通过研究孕激素对绒毛外滋养细胞孕激素受体(PR)和血管内皮生长因子表达的影响,探讨P对绒毛外滋养细胞侵袭能力的影响及维持妊娠的机理。方法采用半定量PCR和定量PCR测定孕激素干预后绒毛外滋养细胞表达PR mRNA和VEGF mRNA的水平。结果(1)不同浓度的孕激素PRA表达量极低,PRB mRNA的表达没有显著差异(P>0.05);(2)VEGF mRNA与孕激素浓度变化无明显相关,反而与PRB mRNA的水平成反比关系。结论(1)孕激素作用的发挥取决于PR的水平,与激素本身的浓度没有明显关系;(2)PRB能下调滋养细胞分泌VEGF的能力从而抑制其侵袭力,提示PR异常可能是导致绒毛外滋养细胞侵袭能力发生改变而引起相关疾病的原因之一。

树突状细胞表面C型凝集素受体表达对绒毛外细胞滋养细胞生物学行为的影响

目的采用基因克隆技术构建C型凝集素受体(CLR)过表达/siRNA慢病毒载体,观察胎盘来源的树突状细胞表面CLR过表达或低表达对人绒毛外细胞滋养细胞(EVCT)侵袭力、黏附能力和凋亡的影响。方法通过质粒转染和RNA干扰技术获取过表达和低表达CLR基因的树突状细胞。将分离、培养及鉴定后的EVCT分别与过表达和低表达CLR基因的树突状细胞共培养(过表达组和低表达组)。采用体外侵袭试验、黏附能力实验和AnnexinⅤ/PI双染法检测共培养对EVCT侵袭、黏附能力及凋亡的影响。以共培养前的EVCT作为对照组。结果过表达组EVCT的侵袭能力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),低表达组EVCT的侵袭能力明显弱于对照组(P<0.01)。过表达组和低表达组与对照组的黏附率比值分别为(94.2±2.3)%和(52.8±1.5)%,低表达组EVCT的黏附能力明显下降(P<0.01)。过表达组、低表达组和对照组的细胞凋亡率分别为(3.9±0.8)%、(8.2±1.4)%和(1.1±0.3)%,低表达组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。结论抑制树突状细胞表面CLR表达可使EVCT的侵袭力和黏附能力显著减弱,凋亡率显著增高;提示树突状细胞表面CLR表达异常可能是EVCT免疫损伤和子痫前期发病的重要机制之一。

甾体激素对绒毛外滋养细胞表达HLA-G蛋白的影响

目的:探讨甾体激素(E_2、P_4)对绒毛外滋养细胞表达HLA-G的影响。方法:将分离培养的绒毛外滋养细胞(EVT)分成E_2组、孕酮(P_4)组、E_2+P_4组和空白对照组,分别向各组EVT培养液中加入不同浓度的17β-雌二醇、孕酮及17β-雌二醇+孕酮,空白对照组则不加任何激素,48h后,流式细胞仪检测各组HLA-G蛋白的表达。结果:①单独使用E_2或P_4均能上调EVT表达HLA- G蛋白,上调作用与其浓度关系密切,与对照组相比,差异有显著性(P＜0．01);②联合应用E_2+P_4亦上调EVT表达HLA-G蛋白,1000 nmol/L的E_2+P_4组HLA-G蛋白的表达,明显高于低浓度组(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L),差异有显著性(P＜0．01);③低浓度的E_2+P_4组(1nmol/L)HLA- G蛋白的表达高于同浓度的P_4组(P＜0．05),而低于同浓度的E_2组(P＜0．001);1000nmol/L,E_2+P_4组HLA-G表达显著高于单纯的E_2、P_4组(P＜0．01)。结论:①低浓度的E_2、P_4对HLA-G调节呈拮抗作用,高浓度E_2和P_4则以协同作用调节HLA-G的表达;②HLA-G可能参与了卵巢甾体激素调节胚胎植入进程。

T细胞对感染人巨细胞病毒的绒毛外滋养细胞的免疫效应研究

目的体外研究T细胞对感染人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的绒毛外滋养细胞的免疫效应。方法从健康育龄妇女外周血中分离纯化获得T细胞,建立T细胞与感染HCMV的HPT-8共培养细胞模型,实时荧光定量PCR检测HPT-8内HCMV DNA负荷量。结果加入HCMV 48 h后,HPT-8胞质内出现大量HC-MV pp65抗原信号;T细胞具有下调HPT-8中HCMV DNA负荷量的作用(P<0.05);T细胞与感染的HPT-8共培养3天后的细胞上清,也具有下调HPT-8中HCMV DNA负荷量的作用(P<0.05);共培养3天后的T细胞则失去了下调HPT-8中HCMV DNA负荷量的作用(P>0.05)。结论 T细胞在母-胎界面HCMV感染初期具有一定的免疫防御作用,其机制可能与T细胞的直接溶解杀伤作用及其分泌的细胞因子相关;但T细胞的免疫功能很快受到抑制,其中的机制有待进一步研究。

不同浓度DⅢ4调节绒毛外滋养细胞的生物学功能

背景:早孕时期绒毛外滋养细胞功能的正常发挥对妊娠有着至关重要的影响,绒毛外滋养细胞功能异常时将导致子痫前期、胎儿生长受限及胎盘植入等多种妊娠期疾病。目的:探讨Notch信号家族配体Dll4对绒毛外滋养细胞的生物学功能的影响。方法:以不同质量浓度外源性Dll4(0,0.125,0.25,0.5,1.0 mg/L)处理人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo,以CCK-8试验检测细胞活性,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力的改变。结果与结论:Dll4可明显促进绒毛外滋养细胞迁移与侵袭能力,而对细胞活性不产生显著影响;Dlll4对绒毛外滋养细胞侵袭功能的影响具有浓度依赖性。结果提示Dll4可通过调节绒毛外滋养细胞生物学功能,在妊娠过程很中发挥重要作用。

人绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养模型的建立

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为。方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下细胞形态变化及侵袭特性,免疫组化、免疫荧光染色检测细胞的纯度。结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,阳性表达转化生长因子β2的细胞数占95%以上,DSC泌乳素阳性表达的细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和DSC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持。上室中的EVCT保持了其侵袭能力,在Matrigel包被的滤膜上EVCT的侵袭指数为3.22±0.04。结论适当的培养方法可获得高纯度的EVCT和DSC,并使其维持特有的生物学活性,成功地建立了共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和胚胎着床的机制。

MMP-9在绒毛外滋养细胞诱导内皮细胞凋亡中作用的研究

目的:探讨绒毛外滋养细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达对血管内皮细胞凋亡的影响。方法:MMP-9的siRNA转染绒毛外滋养细胞株(TEV-1),利用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)和ELISA法检测转染前后细胞中MMP-9、FasL基因及蛋白表达的变化;通过trans well共培养技术,研究滋养细胞对内皮细胞凋亡的影响。结果:(1)MMP-9 siRNA转染后24h,滋养细胞MMP-9 mRNA的表达较对照组明显降低(P<0.05),而FasL mRNA表达与对照组无明显差异(P>0.05);转染后48h,细胞培养液中MMP-9蛋白及FasL蛋白表达均较对照组显著降低(P<0.05);(2)与未转染者比较,转染MMP-9 siRNA的滋养细胞与内皮细胞共培养48h后,内皮细胞凋亡率显著降低,差异有显著性(P<0.05)。结论:绒毛外滋养细胞表达MMP-9的水平影响其诱导内皮细胞凋亡的作用,此作用可能与MMP-9调节FasL蛋白的分泌表达有关。

缺氧/复氧经DNA甲基转移酶途径减弱人绒毛外滋养细胞的迁移和侵袭

目的探讨缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)对人绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast,EVT)侵袭能力的调控机制。方法体外培养EVT永生化细胞系HTR-8/SVneo、早孕胎盘绒毛分离的原代EVT细胞和绒毛外植体,1%O2和20%O2浓度转换条件下模拟EVT细胞侵入子宫时的H/R环境,Western blot、免疫荧光技术检测细胞侵袭等关键因子的表达,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭。结果经H/R诱导后,HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力减弱,体外培养的绒毛外植体的外延能力和分离的原代EVT细胞迁移、侵袭能力均减弱;H/R条件下,HTR-8/SVneo细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9,整合素integrin-β1和integrin-α5蛋白水平降低(P<0.05),DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的蛋白表达亦下调(P<0.01);H/R条件下,原代EVT细胞中上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的正调控因子Slug、Snails等被抑制(P<0.05),上皮细胞标志因子E-cadherin表达上升(P<0.01),MMP-2和-9、integrin-β1和-α5蛋白水平下降(P<0.05),细胞侵袭能力下降并伴随DNMT1、DNMT3A的表达下降(P<0.05)。HTR-8/SVneo细胞中过表达DNMT1、DNMT3A和DNMT3B可促进间质型标志因子N-cadherin、MMP-2和-9的蛋白表达上调(P<0.05)。结论H/R通过DNMTs调控MMP-2/9等EMT相关因子的表达从而减弱EVT细胞迁移和侵袭能力。

SB203580对氧化应激下人绒毛外滋养细胞生物学功能的影响

目的·探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂SB203580对缺氧/复氧条件下人绒毛外滋养细胞生物学功能的影响。方法·选取体外培养的早孕绒毛外植体和人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo,根据干预方式的不同各分为4组:对照组、SB203580组(阻断p38 MAPK信号通路)、缺氧/复氧组(氧化应激模型体外模拟子痫前期)和SB203580+缺氧/复氧组。观察SB203580对氧化应激下早孕绒毛外植体中绒毛外滋养细胞生物学功能的影响。Western blotting检测HTR8/SVneo中p38 MAPK蛋白表达及磷酸化水平,Transwell实验观察细胞侵袭和迁移能力,明胶酶谱法和ELISA法分别检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶2/9(MMP2/9)的活性及可溶性fms样酪氨酸激酶-1(s Flt-1)和可溶性内皮因子(s Eng)的水平。结果·SB203580可促进氧化应激下早孕绒毛外植体中绒毛外滋养细胞的外生性迁移。缺氧/复氧可使HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力下降,p38 MAPK磷酸化水平升高,s Flt-1和s Eng分泌增加;而SB203580可使氧化应激下HTR8/SVneo中p38 MAPK磷酸化水平降低,细胞迁移和侵袭能力提高,细胞培养上清液中MMP2/9活性增加、s Flt-1和s Eng的分泌量减少。结论·SB203580对氧化应激下人绒毛外滋养细胞的生物学功能具有保护作用。

绒毛外滋养细胞侵袭异常与相关妊娠早期疾病的研究进展

在人类妊娠中,早期胎盘的形成和发育通过绒毛外滋养细胞(EVTs)对蜕膜和母体子宫肌层的侵袭实现。EVTs对母体子宫的侵袭是非特异性的,不仅可侵入母体子宫的结缔组织重塑子宫螺旋动脉,还可侵入母体子宫内的其他结构,包括子宫壁内的腺体、静脉和淋巴管等。EVTs对母体子宫侵袭不足与一系列妊娠早期并发症的发生均密切相关,但具体机制目前尚未明确。因此,充分了解EVTs的侵袭功能和途径可以为理解正常胎盘发育过程中EVTs的侵袭提供理论基础,也可为因EVTs侵袭异常导致的相关妊娠疾病(如复发性流产、先兆子痫和输卵管妊娠)研究提供新思路。

甲氧滴滴涕对人绒毛外滋养细胞侵袭能力的影响

目的:探讨甲氧滴滴涕(MXC)对绒毛外滋养细胞侵袭能力的影响。方法:用胰蛋白酶消化后再经流式细胞仪分离得到人绒毛外滋养细胞进行原代培养及鉴定。细胞分为MXC(1μmol/L,3μmol/L、5μmol/L、7μmol/L)处理组及空白对照组,培养12h、24h和48h。用侵袭小室检测每组各时间点的侵袭能力,Western blot检测各组各时间点MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1表达,RT-PCR法检测MMP-9 mRNA、MMP-2 mRNA表达。结果:MXC处理组滋养细胞侵袭能力呈时间剂量依赖型下降,MMP-9 mRNA、MMP-2 mRNA表达下降,MMP-9、MMP-2表达下降,TIMP-2、TIMP-1表达增高。MMP-2及其mRNA下降程度与MXC有时间剂量效应。结论:MXC可通过改变基质金属蛋白酶及其抑制物的比例降低绒毛外滋养细胞侵袭能力。