高糖环境下PLGF基因沉默对人绒毛膜外滋养细胞增殖、迁移及侵袭及Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的探究高糖环境下胎盘生长因子(PLGF)基因沉默对人绒毛膜外滋养细胞(EVCT)的影响。方法体外培养HTR-8/SVneo细胞,将细胞分为对照组(不做处理)、空载组(空载质粒转染)及PLGF沉默组(PLGF双切口酶质粒转染)。CCK-8法、划痕实验及Transwell实验检测各组细胞增殖、迁移、侵袭能力;q RT-PCR及Western blot检测各组细胞PLGF、核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)mRNA及蛋白表达情况。结果对照组与空载组细胞增殖抑制率、划痕愈合率、侵袭细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,PLGF沉默组细胞增殖抑制率升高,划痕愈合率、侵袭细胞数降低(P<0.05)。对照组与空载组PLGF、Nrf2及HO-1 m RNA及蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,PLGF沉默组PLGF、Nrf2及HO-1m RNA及蛋白表达量降低(P<0.05)。结论高糖环境下PLGF基因沉默能够抑制EVCT增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能与抑制Nrf2/HO-1信号通路活性有关。

沉默血管生成素-1对人绒毛膜外滋养细胞增殖迁移及侵袭能力的影响

目的探讨siRNA干扰沉默血管生成素-1(Ang-1)对绒毛膜外滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法将体外培养的人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo分为对照组(未转染)、NC-siRNA组(转染阴性对照siRNA)和Ang-1-siRNA组(转染Ang-1-siRNA)。采用实时定量PCR法检测3组细胞中Ang-1mRNA的表达,Western blot法检测Ang-1、PCNA、MMP-9和VEGF蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖活性,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力。结果与对照组和NC-siRNA组比较,Ang-1-siRNA组细胞中Ang-1、PCNA、MMP-9、VEGF蛋白和Ang-1 mRNA的表达均降低,细胞增殖活性、克隆形成能力、迁移和侵袭能力减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论沉默Ang-1可通过下调PCNA、MMP-9和VEGF表达抑制人绒毛膜外滋养细胞的增殖、迁移和侵袭。

沉默TLR4对人绒毛膜外滋养细胞表达Ang-1 Ang-2及Tie-2的影响

目的探讨沉默Toll样受体4(TLR4)对人绒毛膜外滋养细胞表达血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)、酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)的影响。方法将体外培养的人绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo分为空白对照组(未转染)、NC-siRNA组(转染阴性对照siRNA)和TLR4-siRNA组(转染TLR4-siRNA)。采用qRT-PCR法检测3组细胞中TLR4mRNA的表达,采用Western blot法检测3组细胞中TLR4、Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白的表达。结果转染后,空白对照组、NC-siRNA组、TLR4-siRNA组细胞中TLR4 mRNA表达水平分别为(1.19±0.54)、(1.17±0.49)、(0.46±0.32),TLR4蛋白表达水平分别为(0.68±0.24)、(0.61±0.37)、(0.15±0.16)。3组细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(均P<0.001)。转染后,3组细胞中Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论TLR4可以通过促进人绒毛膜外滋养细胞中Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白的表达,在滋养细胞侵袭、子宫螺旋动脉重铸、胚胎血管发育等过程中发挥重要作用。

血管生成素-1对人绒毛膜外滋养细胞基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9表达的调控作用

目的分析血管生成素-1(Ang-1)对人绒毛膜外滋养细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的调控作用。方法将体外培养的人绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo分为空白对照组(未转染)、NC-siRNA组(转染阴性对照siRNA)及Ang-1-siRNA组(转染Ang-1 siRNA)。采用实时定量PCR法检测3组细胞中Ang-1 mRNA的表达,采用Western blot法检测Ang-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表达,采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力。结果转染48 h后,空白对照组Ang-1 mRNA表达水平为(1.36±0.04),NC-siRNA组Ang-1 mRNA表达水平为(0.98±0.07),Ang-1-siRNA组Ang-1 mRNA表达水平为(0.24±0.02),3组比较差异有统计学意义(F=257.128,P<0.001)。空白对照组Ang-1蛋白水平为(0.54±0.03),NC-siRNA组Ang-1蛋白水平为(0.49±0.07),Ang-1-siRNA组Ang-1蛋白水平为(0.12±0.06),3组比较差异有统计学意义(F=84.326,P<0.001)。转染48 h后,空白对照组MMP-2蛋白表达水平为(0.78±0.03),NC-siRNA组MMP-2蛋白表达水平为(0.71±0.04),Ang-1-siRNA组MMP-2蛋白表达水平为(0.39±0.02),3组比较差异有统计学意义(F=89.532,P<0.001)。空白对照组MMP-9蛋白表达水平为(0.86±0.06),NC-siRNA组MMP-9蛋白表达水平为(0.83±0.04),Ang-1-siRNA组MMP-9蛋白表达水平为(0.41±0.02),3组比较差异有统计学意义(F=121.327,P<0.001)。空白对照组、NC-siRNA组及Ang-1-siRNA组穿膜细胞数分别为(69.43±5.67)个、(65.83±5.78)个及(25.89±5.38)个,3组比较差异有统计学意义(F=85.609,P<0.001)。结论Ang-1在子宫螺旋动脉重铸过程中发挥着重要作用,Ang-1可能通过上调MMP-2和MMP-9的表达,促进绒毛膜外滋养细胞的侵袭。

HCMV感染与滋养细胞HLA-E蛋白表达的相关性

目的:研究HCMV感染与滋养细胞HLA-E蛋白表达的相关性。方法:体外分离、培养的滋养细胞系HTP-8,用HCMV AD169标准病毒株感染细胞。免疫荧光法检测HCMV感染后滋养细胞中HLA-E蛋白的表达。结果:病毒感染后10天内,细胞胞浆和胞膜均有HLA-E蛋白表达,感染后1-5天表达水平较低,6-10天表达强度显著增强。结论:滋养细胞HLA-E蛋白的表达与HCMV感染有相关性。

基于iTRAQ联合2D LC-MS/MS分析PM2.5对人类胎盘滋养细胞的影响

目的:利用蛋白组学方法初步筛选PM2.5通过影响人类胎盘滋养细胞造成不良妊娠率增加可能涉及的蛋白分子和生物进程。方法:用0、30、60、120和200μg/mL的PM2.5分别染毒HTR-8/SVneo细胞24 h与48 h后观察细胞增殖情况,最终确定以120μg/mL PM2.5染毒细胞24 h和48 h进行后续实验。提取胞内蛋白,酶解消化后,同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)标记联合二维液相色谱串联质谱(2D LC-MS/MS)技术分析肽段,鉴定HTR-8/SVneo细胞内的差异表达蛋白,并进行生物信息学分析。结果:120μg/mL PM2.5染毒24 h和48 h后的存活率分别为86.09%和52.36%,与对照组(0μg/mL PM2.5染毒组)相比,细胞存活率显著下降(P<0.05)。120μg/mL PM2.5 24 h染毒组和48 h染毒组细胞中分别鉴定出182个和486个差异蛋白,涉及细胞生物进程22条和217条。结论:PM2.5对HTR-8/SVneo细胞的影响涉及大量细胞生物进程的改变;iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术是一种对染毒后细胞内差异表达蛋白高敏感度、高通量筛选的有效途径,为今后对PM2.5增加不良妊娠结局风险的深入机制研究奠定基础。

苯并芘代谢产物BPDE的细胞毒性研究及五味子乙素在预防HTR-8/SVneo细胞损伤中的作用

目的:探讨苯并芘[Benzo(a)pyrene,BaP]代谢产物二氢二醇环氧苯并芘[7,8 dihydrodiol 9,10epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE]对人绒毛膜外滋养细胞株HTR-8/SVneo的毒性效应及五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)对BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞损伤的保护作用。方法:以HTR-8/SVneo细胞为载体,构建BPDE对HTR-8/SVneo细胞的染毒模型和Sch B对HTR-8/SVneo细胞的保护模型,利用MTS细胞增殖实验检测不同浓度的BPDE单独给药和Sch B联合BPDE给药对HTR-8/SVneo细胞增殖的影响。结果:5μmol/L BPDE即可使细胞活力显著下降,活细胞数仅占总细胞数的38.23%。经不同浓度的Sch B(0.625、1.25、2.5、5、10和20μmol/L)预处理后再以BPDE干预,细胞活力较前明显上升,分别为40.11%、42.68%、46.47%、47.34%、61.37%和49.87%,其保护作用在0.625~10μmol/L之间呈浓度依赖关系。结论:BPDE对HTR-8/SVneo细胞产生剂量依赖的毒性效应;Sch B(0.625~10μmol/L)对BPDE诱导的细胞损伤有保护作用。

五味子乙素对BaP致HTR8-SVneo细胞损伤的保护作用及机制

目的:研究五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)预防苯并芘(Ba P)致人绒毛膜外滋养层细胞(HTR8-SVneo)损伤的作用机制。方法:通过新型四唑化合物(MTS)法观察和测定,最终选取0.5,1,2μmol/L Sch B分别作用HTR8-SVneo细胞24 h后再给予20μmol/L Bap染毒处理24 h,MTS检测各组细胞生长情况;JC-1荧光染色法观察各组线粒体膜电位荧光强度变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞内促凋亡蛋白(Bax)、细胞色素C(cytochromec,cyt-c)蛋白浓度;蛋白质印迹法(Western blotting)检测各组的凋亡蛋白(Caspase-9)。结果:1Ba P染毒组OD值为1.187±0.015,0.5,1,2μmol/L Sch B预保护24 h后的OD值分别为1.483±0.022、1.489±0.048和1.531±0.240,差异有统计学意义(P<0.05)。2Ba P染毒组线粒体荧光强度弱,0.5,1,2μmol/L Sch B预保护24 h后的荧光强度较强,差异有统计学意义(P<0.05)。3Ba P染毒组Bax、cyt-c蛋白浓度升高,0.5,1,2μmol/L Sch B预保护24 h后细胞内Bax、cyt-c蛋白浓度降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4Ba P染毒组细胞内caspase-9蛋白表达升高,0.5,1,2μmol/L Sch B预保护24 h后细胞内caspase-9蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Sch B可以预防Ba P致HTR8-SVneo细胞损伤,其作用机制可能与抗线粒体途径有关。

五味子乙素对BaP致HTR8-SVneo细胞DNA氧化损伤的保护作用

目的:研究环境污染物苯并(a)芘(Ba P)致人绒毛膜滋养层细胞HTR8-SV neo DNA氧化损伤的作用机制,探讨五味子乙素(Sch B)的可能保护作用。方法:本实验分为空白组、Ba P组、Sch B不同浓度组(0.1、0.5、2μmol/L),以HTR8-SV neo细胞为载体,构建Ba P氧化应激损伤模型,测定芳香烃受体(AHR)基因表达量,DNA的损伤情况,人X射线修复交差互补组1(XRCC1)和人多聚ADP核糖聚合酶(PARP1)基因及蛋白的表达水平。结果 :相比Ba P组,五味子乙素预处理组细胞AHR mRNA表达量及DNA损伤程度明显减轻(P<0.05),而细胞内XRCC1、PARP1 mRNA和蛋白的表达量逐渐增加(P<0.05)。结论:五味子乙素能预防Ba P致HTR8-SVneo细胞DNA的氧化损伤。

五味子乙素通过NOS/NO系统预防BaP所致HTR8-SVneo细胞氧化损伤

目的研究五味子乙素(Sch B)预防环境污染物苯并(a)芘(BaP)致人绒毛膜滋养层细胞HTR8-SVneo氧化损伤的机制。方法以HTR8-SVneo细胞为载体,构建BaP氧化应激模型。实验分为3组,BaP组、Sch B组和空白对照组。MTS法检测细胞存活率,还原酶法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)及总一氧化氮合酶(TNOS)含量,用RT-PCR法检测细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA水平。结果 BaP组细胞存活率(72.2±0.9)%较对照组显著下降(P<0.05);而0.1、0.5或2μmol/L Sch B+20μmol/L BaP各组的细胞存活率分别为(78.2±1.5)%、(86.5±0.6)%、(93.4±1.0)%,显著高于BaP组(P<0.05)。BaP组细胞培养液中NO、TNOS含量、iNOS、eNOS mRNA表达量和eNOS蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05);而与BaP组相比,Sch B组中NO、TNOS含量,iNOS、eNOS mRNA表达量和eNOS蛋白表达量均随着Sch B剂量的增加逐渐下降(P<0.05)。结论 Sch B可有效预防BaP所致的HTR8-SVneo细胞氧化损伤,其机制可能与NOS/NO系统的平衡有关。

人脐带间充质干细胞条件培养基联合白藜芦醇对人滋养层细胞的作用

目的:探讨人脐带间充质干细胞条件培养基联合白藜芦醇对人绒毛膜外滋养层细胞凋亡的影响。方法:通过CCK8细胞活力检测试剂盒测定白藜芦醇及其与人脐带间充质干细胞条件培养基共同处理人绒毛膜外滋养层细胞HTR8后对细胞增殖及活性的影响;细胞迁移试验检测白藜芦醇和人脐带间充质干细胞条件培养基对细胞迁移能力的影响;显微镜观察细胞形态,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;Western blot检测白藜芦醇和人脐带间充质干细胞条件培养基对细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及迁移相关蛋白MMP-9表达的影响。结果:白藜芦醇能够抑制HTR8细胞增殖,抑制细胞迁移及MMP-9蛋白的表达,改变Bax和Bcl-2蛋白表达诱导细胞凋亡的作用。而人脐带间充质干细胞条件培养基能够逆转白藜芦醇对细胞的抑制作用。结论:人脐带间充质干细胞条件培养基能够通过调控Bax、Bcl-2、MMP-9的蛋白表达逆转白藜芦醇对人绒毛膜外滋养层细胞的抑制作用。人脐带间充质干细胞条件培养基可作为潜在的治疗人绒毛膜外滋养层细胞功能障碍的临床手段,孕妇需要小心使用白藜芦醇。