单增李斯特菌感染人绒毛膜滋养层细胞比较蛋白质组学研究

目的分析单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)感染人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo过程中引起的细胞蛋白质组变化。从宿主细胞分子水平对单增李斯特菌感染胎盘的机制进行研究。方法运用TMT(Tandem Mass Tags)蛋白质组学技术对HTR-8/Svneo感染组和非感染组蛋白质组进行定量分析,运用GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异表达蛋白进行分子功能、生物过程及代谢途径富集分析。结果共鉴定肽段76285个,可定量蛋白6979个。HTR-8/Svneo感染过程中356个蛋白发生了显著性差异表达。153个表达量上调,203个表达量下调。差异表达量倍数最高的蛋白为微管马达蛋白(B4DYE2),最低为翻译起始因子1(Q6IAV3)。GO功能富集和KEGG代谢途径富集结果表明,上调蛋白参与的生物过程和代谢途径集中在微管、微丝运动,细胞自噬等方面,下调蛋白集中在碳代谢、氮代谢、氨基酸生物合成、核酸代谢等初级代谢途径和泛素介导的蛋白质水解等方面。结论单增李斯特菌侵袭HTR-8/Svneo过程中,宿主细胞的基础代谢可能发生了显著降低,并处于较高的自噬水平。细胞迁移诱导透明质酸酶CEMIP(Q8WUJ3)的显著上调说明该蛋白可能在调节滋养层细胞迁移、侵袭能力进而造成不良妊娠方面具有重要作用,为单增李斯特菌感染胎盘分子机制研究提供新的思路。

黄芪甲苷对高糖诱导人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)焦亡及侵袭迁移的影响

【目的】探讨黄芪甲苷对高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)焦亡及侵袭迁移的影响。【方法】将HTR-8/SVneo细胞分为4组:对照组(未处理)、高糖组(高糖刺激)及黄芪甲苷50、100μmol/L组(高糖刺激+黄芪甲苷)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力,分别采用Transwell实验和划痕实验测定细胞侵袭、迁移能力,Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)双荧光染色评估细胞焦亡情况,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶剪切体(cleaved-Caspase-1)、消皮素D-N端(GSDMD-NT)、白细胞介素18(IL-18)蛋白表达水平。【结果】与对照组比较,高糖组HTR-8/SVneo细胞活力显著降低,细胞迁移率显著降低,侵袭细胞数显著减少,PI阳性细胞比例显著增加,NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-NT、IL-18蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);与高糖组比较,黄芪甲苷处理组细胞活力显著升高,细胞迁移率显著增加,侵袭细胞数显著增加,PI阳性细胞比例显著下降,NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-NT、IL-18蛋白表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01)。【结论】黄芪甲苷可抑制高糖诱导的HTR-8/SVneo细胞焦亡,改善细胞侵袭及迁移能力。

SHP-2对人绒毛膜滋养层细胞增殖、侵袭、迁移和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响

目的探讨Src同源物2磷酸酶2(SHP-2)对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo增殖、侵袭、迁移和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响。方法用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SHP-2在子痫前期(PE)组胎盘组织中的表达水平。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、克隆形成实验、划痕闭合和Transwell分析检测敲低或过表达SHP-2对人绒毛膜滋养细胞(HTR-8/SVneo)增殖、集落形成、迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测侵袭相关蛋白的表达和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。结果HP-2在PE组胚胎组织中低表达。敲低SHP-2显著抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖、集落形成、侵袭和迁移,此外,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达显著下调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达显著上调,PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低,然而,过表达SHP-2具有相反的效果。结论SHP-2在PE胎盘组织中低表达,SHP-2过表达可促进滋养层细胞的增殖、侵袭和迁移能力,提示SHP-2可能是临床治疗PE的潜在靶点。

METTL3对人绒毛膜滋养层细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K/AKT信号通路蛋白的调控作用

目的探讨甲基转移酶样蛋白3(METTL3)在子痫前期(PE)患者胎盘组织中的表达,并分析METTL3对人绒毛膜滋养层细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制。方法选择行剖宫产分娩的PE产妇15例、行剖宫产分娩的正常产妇15例。收集PE产妇及正常产妇胎盘组织,采用qRT-PCR法检测METTL3 mRNA表达水平。取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo,分为空白对照组、空载对照组和过表达METTL3组,空白对照组正常培养,空载对照组感染阴性对照慢病毒,过表达METTL3组感染过表达METTL3慢病毒。采用CCK-8法观察三组细胞增殖能力,Tran⁃swell实验观察细胞迁移和侵袭能力,Western blotting法检测细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平。结果与正常产妇胎盘组织相比,PE产妇胎盘组织METTL3 mRNA表达水平升高(P均<0.01)。与空白对照组以及空载对照组相比,过表达METTL3组细胞增殖活力降低,细胞迁移数量、细胞侵袭数量减少,细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平降低(P均<0.01)。空白对照组与空载对照组上述指标比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论PE患者胎盘组织中METTL3表达升高;METTL3可能通过调控PI3K/AKT信号通路影响人绒毛膜滋养层细胞增殖、迁移和侵袭,从而参与PE的发生发展。

雌二醇和孕酮对绵羊绒毛膜滋养层多核细胞形成的影响

以绵羊绒毛膜滋养层细胞(primary sheep trophoblast cells,STCs)和子宫内膜腔上皮细胞(endometrial luminal epithelial cells,ELECs)的共培养体系为研究对象,通过添加不同浓度的雌二醇(17β-estrodiol,E2)和孕酮(progesterone,P4)以研究其对绵羊绒毛膜滋养层多核细胞形成的影响,为探究绵羊的胎盘生长发育提供试验依据。首先采用姬姆萨染色法观察绒毛膜滋养层多核细胞的数量,以此来确定E2和P4的最佳工作浓度;而后根据最佳的工作浓度设立E2和P4联合使用组,来观察其对多核细胞数量的影响。结果显示:单独添加E2使滋养层多核细胞数量明显增多,单独加入P4使滋养层多核细胞的数量明显减少,且随着E2和P4浓度的升高滋养层多核细胞的数量均表现出先增多后减少的趋势,而当E2和P4浓度均为10-7 mol/L时,滋养层多核细胞的数量最多,且与对照组相比呈显著性差异(P<0.05);E2和P4联合使用后,同样表现出E2的促进作用和P4的抑制作用。结果表明,在妊娠中期,E2的加入有促进绒毛膜滋养层多核细胞的形成作用,而P4的加入具有抑制其形成的作用,这为绵羊胚胎发育机制的研究奠定基础。

miR-30c-5p通过调节Notch1的表达抑制人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移、侵袭和管状形成

目的:探讨miR-30c-5p通过调节Notch1表达对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移、侵袭和管状形成调控的机制,确定其在子痫前期发病中的潜在作用。方法:在体外对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo进行培养,慢病毒系统构建miR-30c-5p过表达及敲低稳转HTR-8/SVneo细胞系。分为对照组、导入miR-30c-5p过表达质粒组和导入miR-30c-5p敲低质粒组。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-30c-5p和Notch1基因的表达量,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中Notch1蛋白的表达量,划痕愈合实验、Transwell侵袭实验和管状形成实验分别检测各组细胞的迁移、侵袭和管状形成能力。结果:与对照组比较,miR-30c-5p过表达质粒组中细胞的miR-30c-5p基因表达水平升高(P<0.0001),细胞Notch1蛋白表达水平下降(P<0.01),细胞迁移(P<0.01)、侵袭(P<0.001)和管状形成能力(P<0.05)均受到抑制。反之,miR-30c-5p敲低质粒组中细胞的miR-30c-5p基因表达水平下降(P<0.01),细胞Notch1蛋白表达升高(P<0.001),细胞的迁移(P<0.01)、侵袭(P<0.05)以及细胞的管状形成能力(P<0.01)增强。结论:miR-30c-5p能够通过抑制Notch1的表达降低人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移、侵袭和管状形成能力,参与子痫前期的发病。

绵羊绒毛膜滋养层细胞与子宫内膜腔上皮细胞共培养体系的建立

本研究旨在探索绵羊绒毛膜滋养层细胞(sheep trophoblast cells, STCs)和子宫内膜腔上皮细胞(endometrial luminal epithelial cells, ELECs)的共培养条件,为绵羊胎盘绒毛膜滋养层多核细胞的形成提供试验依据。在屠宰场采集妊娠45～60 d的健康绵羊子宫及胎盘组织,用酶消化法体外分离培养STCs和ELECs,并进行细胞免疫荧光鉴定,同时利用姬姆萨氏染色法确定STCs和ELECs最佳的共培养条件;然后转染空质粒pEGFP-C1到ELECs 48 h后,与STCs共培养,并利用激光共聚焦显微镜观察滋养层多核细胞的形态。结果显示:STCs CK-7与ELECs CK-18均呈阳性;当STCs与ELECs细胞数量比值为2∶1,共培养48 h,多核细胞数量最多,且与对照组相比差异显著(P<0.05);CK-7在STCs中表达呈红色荧光,且细胞中有pEGFP-C1标记的绿色荧光,胞核蓝染,3种荧光共表达呈现出了白光。综上表明,本研究建立了STCs和ELECs共培养条件,ELECs参与绵羊滋养层多核细胞的形成。

人早孕期蜕膜和绒毛外滋养层细胞的免疫组织化学研究

侵入蜕膜组织的绒毛外滋养层细胞在HE染色标本上不易辨认。我们用免疫组织化学,ABC法,过氧化物-抗过氧化物酶标记蜕膜组织中的hCG与hPL阳性细胞。结果证明,子宫内膜中只要有一个绒毛外滋养层细胞存在就能被显示出来。这对提高妊娠诊断,防止残留滋养层细胞的增生与恶性病变很有意义。我们在蜕膜组织中还发现3类胎盘激素阳性细胞:hCG阳性细胞,hPL阳性细胞及hCG与hPL均为阳性的细胞。这一发现,证明了蜕膜有内分泌功能。

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养，胰蛋白酶消化法行传代培养，免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时，细胞开始由组织块边缘向外生长；１５ｄ时，即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。

人胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养(英文)

目的 建立纯度较高的适于试验研究的人绒毛膜滋养层细胞 .方法 胰蛋白酶 - DNase联合消化法培养人绒毛膜滋养层细胞 ,间接免疫染色进行细胞鉴定 ,透射电镜观察细胞内部结构 .结果 倒置显微镜下 ,可见细胞呈不规则多角形 ,核大卵圆形 ,胞质透明 ,呈片状铺展生长 .角蛋白染色阳性率超过 95 % ,未检测到波型蛋白阳性细胞 ,表明不含污染细胞 .透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构 .结论 该法简便易行 。

枸杞多糖对体外培养的人绒毛膜滋养层细胞影响的研究

通过组织培养法,观察对照组及100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml LBP组中滋养层细胞的生长。通过观察各组HCG阳性细胞数及测定培养液中HCG分泌量的变化,探讨LBP对滋养层细胞分化的作用。结果:LBP组滋养层细胞均生长旺盛,HCG阳性细胞数明显多于对照组(P<0.01)。在无血清培养条件下,各组HCG分泌量无显著性差异,而有血清培养条件下,LBP组HCG分泌量分别为0.43,0.34和0.42Iμ/ml/10mg组织,几乎是对照组的2倍,(对照组仅为0.22Iμ/ml/10mg组织)。结论:LBP对体外培养的滋养层细胞具有营养和保护作用,而不是诱导分化。

enJSRV囊膜蛋白及其受体的瞬时表达与绵羊绒毛膜滋养层细胞融合的诱导研究

旨在深入研究内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白在绵羊胎盘形成过程中的作用,本研究体外培养了蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞,采用RT-PCR技术扩增出enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因全长序列,定向克隆于真核表达载体pEGFP-C1上。优化绒毛膜滋养层细胞电转染条件和测定电转效率。将构建好的真核表达质粒分别电转染到绒毛膜滋养层细胞中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。并研究高表达enJSRV-env基因及通过RNA干扰沉默enJSRV-env基因对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合活性的影响。结果显示,真核表达质粒构建成功,分别命名为pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究表明,绵羊绒毛膜滋养层细胞最佳电转染条件为脉冲电压150 V,脉冲时间5.0 ms,电击2次,间隔50 ms。转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒及pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2共转染的绵羊绒毛膜滋养层细胞中多核细胞数目明显增加,平均每个视野分别可以观察到1.8和2.3个多核细胞。说明enJSRV-env对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合有一定的促进作用。本研究为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能及绒毛膜滋养层细胞融合机理提供试验基础。

人绒毛膜滋养层细胞的培养

取妊娠 ６～１０周的人妊娠早期绒毛膜，用胰酶／ＤＮＡ酶消化，换瓶纯化处理，经光镜和电镜检测证实，我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。

糖皮质激素对人绒毛膜滋养层细胞11β-HSD1的调节

目的 :研究糖皮质激素对 1 1 β 羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型 (1 1 β hydroxysteroiddehydrogenasetype 1 ,1 1 β HSD1 )还原酶活性和mRNA表达的调节。方法 :利用原代培养的人类绒毛膜滋养层细胞 ,运用免疫细胞化学染色方法、放射性酶活性测定及Northern印迹杂交技术 ,结合图像分析技术检测 1 1 β HSD1mRNA的表达量。 结果 :1 1 β HSD1和糖皮质激素受体 (glucocorticoidreceptor,GR)免疫活性样物质共存于原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中 ,人工合成的糖皮质激素———地塞米松对绒毛膜滋养层细胞 1 1 β HSD1还原酶活性和mRNA表达具有诱导作用 ,此诱导作用可以被GR阻断剂RU486所阻断。结论 :糖皮质激素与GR结合后上调绒毛膜滋养层细胞 1 1 β

人绒毛膜滋养层细胞的体外培养

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织 ,进行原代培养 ,胰蛋白酶消化法传代培养 ,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果 原代培养滋养层细胞 3h后开始贴壁 ,18h后全部贴壁 ,3天可传代 ,角蛋白、波形蛋白染色细胞纯度达 95 %以上。结论 胰蛋白酶、胶原酶消化法简便易行 ,可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞 ,建立了稳定的人类绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。

TNF-α与IFN-γ诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡

探讨ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ诱导妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡的作用。方法 建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系：利用台盼蓝染色记数、光镜、透射电镜、ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳观察和检测ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ处理后的细胞凋亡情况。结果ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ可引起活细胞数减少；透射电镜观察到染色体边集、核固缩、凋亡小体：ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳有“梯形条带”。结论ＴＮＦ－α能够诱导人妊娠早期绒毛滋养层细胞凋亡，ＩＦＮ－γ对ＴＮＦ－α有协同作用。

绒毛膜促性腺激素(HCG)及表皮生长因子受体(EGFR)在人早孕滋养层细胞的表达

目的 :对早孕绒毛膜滋养层细胞中EGFR、HCG的表达作定位、定性研究。方法 :取停经 45～ 5 5天健康妇女人工流产的绒毛组织 ,固定 ,石蜡包埋 ,切片 ,用ABC法进行抗HCG及抗EGFR免疫组织化学染色 ,光镜观察。结果 :合体滋养层细胞HCG强阳性反应 ,细胞滋养层细胞HCG阴性 ,部分中间型滋养层细胞HCG阴性或弱阳性 ;合体滋养层和中间型滋养层细胞胞质和核膜EGFR中度阳性 ,细胞滋养层细胞膜、核膜EGFR中度阳性、胞质弱阳性 ,各层滋养层细胞核EG FR弱阳性。结论 :为进一步研究EGF EGFR调控滋养层细胞合成分泌HCG奠定了基础。

miR-130b-5p下调胰岛素样生长因子-1抑制人绒毛膜滋养层细胞迁移及侵袭的作用及机制

【目的】探究微小RNA 130b-5p(miR-130b-5p)靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)迁移及侵袭的影响。【方法】将HTR8/SVneo细胞分为对照组、miR-NC组、miR-130b-5pmimics组、miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1组和miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1组,双荧光素酶报告基因检测miR-130b-5p和IGF-1的靶向关系;采用实时荧光定量PCR检测HTR8/SVneo细胞样本中miR-130b-5p及IGF-1表达水平;采用CCK-8法检测HTR8/SVneo细胞增殖情况;采用全息细胞仪及Transwell法分析HTR8/SVneo细胞迁移、侵袭能力;Western blot法检测HTR8/SVneo细胞样本中IGF-1及侵袭、上皮间充质转化(EMT)蛋白表达情况。【结果】双荧光素酶报告基因结果显示,IGF-1是miR-130b-5p的潜在靶基因;相较于miR-NC组,miR-130b-5pmimics组中miR-130b-5p表达水平、细胞增殖抑制率、钙粘附蛋白E(E-cadherin)表达水平显著增加,IGF-1、c-Myc、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达水平、迁移距离、侵袭细胞数、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平显著降低(P<0.05);相较于miR-130b-5pmimics+pcD⁃NA3.1组,miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1组中细胞增殖抑制率、E-cadherin表达水平显著降低,c-Myc、Cy⁃clinD1表达水平、迁移距离、侵袭细胞数、MMP9、MMP2、Vimentin和N-cadherin表达水平显著增加(P<0.05)。【结论】miR-130b-5p过表达可能通过抑制IGF-1表达来抑制HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭。

枸杞多糖对体外培养的人绒毛膜滋养层细胞影响的免疫细胞化学研究

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)是从枸杞子中提取的有效成分。近年来的研究表明 LBP 能提高机体免疫力,可有效地抗氧自由基、防止胸腺细胞凋亡、保护睾丸细胞免受较高温度的损伤等作用。临床中枸杞子也常被用于与其他药物配伍辨证治疗男女不孕症等。本研究将 LBP 引入绒毛膜滋养层细胞培养,旨在观察 LBP 对早期绒毛膜滋养层细胞的生长及对人绒毛膜促性腺激素(hCG)分泌的影响,为 LBP 的临床及实验室应用提供有参考价值的实验依据。材料与方法1 材料绒毛组织取自正常妊娠6～8周人工流产材料,由南京医科大学附属医院门诊提供。LBP 购自宁夏中药厂。

分散人绒毛膜滋养层细胞及细胞培养

目的 获取人绒毛膜滋养层细胞。方法 应用胰酶 /DNA酶法进行消化后进行培养。经光镜和电镜观察。结果 我们获取了人绒毛滋养层细胞并成功培养。结论 取人妊娠 4 5～ 5 5D刮宫术后的绒毛组织 ,经胰酶。