采用miR-148a低表达人绒毛膜滋养细胞构建的子痫前期模型细胞活力、焦亡、炎性和氧化应激反应观察

目的观察采用微小RNA-148a(miR-148a)低表达人绒毛膜滋养细胞系HTR-8/SVneo构建的子痫前期(Preeclampsia,PE)模型细胞的细胞活力、焦亡、炎症和氧化应激反应。方法取对数生长期人绒毛膜滋养细胞系HTR-8/SVneo,分为甲、乙、丙、丁组:甲组细胞用抑制miR-148a表达的miR-148a inhibitor转染24 h,加入100 ng/L的LPS培养24 h(建立PE模型);乙组细胞用空白对照NC-inhibitor转染24 h,加入100 ng/L的LPS培养24 h;丙组加入100 ng/L的LPS培养24 h;丁组不做任何处理。培养48 h时,采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-148a,采用CCK8法检测各组细胞活力,采用TUNEL法测算各组细胞焦亡率,采用Western Blotting法检测各组细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD,采用ELISA法检测各组上清液炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6]及氧化应激指标[谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]。结果与丁组相比,丙组细胞miR-148a相对表达量高,培养24、48、72 h时OD值低,细胞焦亡率高,细胞Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量高(P均<0.05);与乙组相比,甲组细胞miR-148a相对表达量低,培养24、48、72 h时OD值高,细胞焦亡率低,细胞Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白相对表达量低(P均<0.05)。与丁组相比,丙组细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平高,细胞GSH和SOD表达降低、MDA表达升高(P均<0.05);与乙组相比,甲组细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平低,细胞GSH和SOD表达升高、MDA表达降低(P均<0.05)。结论miR-148a低表达HTR-8/SVneo细胞构建的PE模型细胞活力高,细胞焦亡程度、炎性反应及氧化应激反应低。miR-148a可能是PE的治疗靶点之一。

HBV阳性血清体外感染人绒毛膜滋养细胞株JEG-3的研究

目的 建立乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）体外感染人绒毛膜滋养细胞株JEG-3的模型,探讨HBV宫内感染的可能危险因素.方法 对人绒毛膜滋养细胞株JEG-3进行传代培养,将不同复制水平的HBV阳性血清与传代培养的JEG-3细胞在无人为干扰因素下共同孵育48~72小时,实时荧光定量PCR方法检测细胞内HBV-DNA的复制水平.结果 在无人为干扰因素下,HBV阳性血清体外可感染人绒毛膜滋养细胞株JEG-3,正常人血清细胞中未能检测出HBV-DNA;低、中危组细胞内也未检测出HBV-DNA;高危组复制水平为4.56×103U/mL,极高危组复制水平为2.72×104U/mL,随着HBV阳性血清复制水平的提高,JEG-3细胞内HBV复制水平有升高的趋势.结论 HBV体外可感染人绒毛膜滋养细胞株JEG-3,HBV高复制水平可能是其宫内感染的独立危险因素之一.

miR-200c对人绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭、EMT的影响及其分子机制

目的探讨miR-200c对人绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭及上皮—间质转化(EMT)的影响,并探讨其可能的分子机制。方法将人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo分为过表达组、沉默组及对照组,应用脂质体转染法分别转染miR-200c模拟物(miR-200c mimics)、miR-200c抑制物(miR-200c inhibitor)、miRNA阴性对照(miR-NC)。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-200c表达,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察各组细胞迁移和侵袭能力(分别以细胞迁移率和侵袭细胞数表示),Westernblotting法检测各组细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Fibro⁃nectin)和Notch1蛋白相对表达量。双荧光素酶报告基因实验验证miR-200c与Notch1的靶向关系。结果过表达组、对照组和沉默组细胞miR-200c相对表达量依次降低,细胞迁移率和侵袭细胞数依次升高,组间两两比较P均<0.05。过表达组、对照组、沉默组E-cadherin蛋白相对表达量依次降低,N-cadherin、Fibronectin和Notch1蛋白相对表达量依次升高,组间两两比较P均<0.05。转染Notch1-WT(野生型)和miR-200c mimics的细胞相对荧光素酶活性为0.31±0.09,转染Notch1-WT和miR-NC的细胞为0.99±0.03(P<0.05);转染Notch1-MUT(突变型)和miR-200c mimics的细胞相对荧光素酶活性为1.00±0.05,转染Notch1-MUT和miR-NC的细胞为1.02±0.04(P>0.05)。结论miR-200c能够抑制人绒毛膜滋养细胞的迁移、侵袭及EMT,其机制可能与靶向调控Notch1有关。

miR-519d对绒毛膜滋养细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及机制

目的观察miR-519d对绒毛膜滋养细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响,并探讨可能的作用机制。方法体外培养人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo,将HTR-8/SVneo细胞分为实验组和对照组,分别转染miR-519d mimics和NC-mimics,采用CCK-8实验检测两组细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力,采用Westernblotting法检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白。应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-519d与MMP-2的靶向关系。结果实验组细胞增殖、侵袭、迁移能力均低于对照组,MMP-2蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.05)。双荧光素酶报告基因证实,miR-519d能够靶向结合MMP-2的3'非编码区,MMP-2是miR-519d的靶基因。结论miR-519d高表达能够抑制绒毛膜滋养细胞增殖、侵袭、迁移能力,其机制可能与调控MMP-2表达有关。

黄芪甲苷对高糖诱导人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)焦亡及侵袭迁移的影响

【目的】探讨黄芪甲苷对高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)焦亡及侵袭迁移的影响。【方法】将HTR-8/SVneo细胞分为4组:对照组(未处理)、高糖组(高糖刺激)及黄芪甲苷50、100μmol/L组(高糖刺激+黄芪甲苷)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力,分别采用Transwell实验和划痕实验测定细胞侵袭、迁移能力,Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)双荧光染色评估细胞焦亡情况,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶剪切体(cleaved-Caspase-1)、消皮素D-N端(GSDMD-NT)、白细胞介素18(IL-18)蛋白表达水平。【结果】与对照组比较,高糖组HTR-8/SVneo细胞活力显著降低,细胞迁移率显著降低,侵袭细胞数显著减少,PI阳性细胞比例显著增加,NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-NT、IL-18蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);与高糖组比较,黄芪甲苷处理组细胞活力显著升高,细胞迁移率显著增加,侵袭细胞数显著增加,PI阳性细胞比例显著下降,NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-NT、IL-18蛋白表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01)。【结论】黄芪甲苷可抑制高糖诱导的HTR-8/SVneo细胞焦亡,改善细胞侵袭及迁移能力。

SHP-2对人绒毛膜滋养层细胞增殖、侵袭、迁移和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响

目的探讨Src同源物2磷酸酶2(SHP-2)对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo增殖、侵袭、迁移和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响。方法用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SHP-2在子痫前期(PE)组胎盘组织中的表达水平。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、克隆形成实验、划痕闭合和Transwell分析检测敲低或过表达SHP-2对人绒毛膜滋养细胞(HTR-8/SVneo)增殖、集落形成、迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测侵袭相关蛋白的表达和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。结果HP-2在PE组胚胎组织中低表达。敲低SHP-2显著抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖、集落形成、侵袭和迁移,此外,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达显著下调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达显著上调,PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低,然而,过表达SHP-2具有相反的效果。结论SHP-2在PE胎盘组织中低表达,SHP-2过表达可促进滋养层细胞的增殖、侵袭和迁移能力,提示SHP-2可能是临床治疗PE的潜在靶点。

高糖环境下PLGF基因沉默对人绒毛膜外滋养细胞增殖、迁移及侵袭及Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的探究高糖环境下胎盘生长因子(PLGF)基因沉默对人绒毛膜外滋养细胞(EVCT)的影响。方法体外培养HTR-8/SVneo细胞,将细胞分为对照组(不做处理)、空载组(空载质粒转染)及PLGF沉默组(PLGF双切口酶质粒转染)。CCK-8法、划痕实验及Transwell实验检测各组细胞增殖、迁移、侵袭能力;q RT-PCR及Western blot检测各组细胞PLGF、核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)mRNA及蛋白表达情况。结果对照组与空载组细胞增殖抑制率、划痕愈合率、侵袭细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,PLGF沉默组细胞增殖抑制率升高,划痕愈合率、侵袭细胞数降低(P<0.05)。对照组与空载组PLGF、Nrf2及HO-1 m RNA及蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,PLGF沉默组PLGF、Nrf2及HO-1m RNA及蛋白表达量降低(P<0.05)。结论高糖环境下PLGF基因沉默能够抑制EVCT增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能与抑制Nrf2/HO-1信号通路活性有关。

METTL3对人绒毛膜滋养层细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K/AKT信号通路蛋白的调控作用

目的探讨甲基转移酶样蛋白3(METTL3)在子痫前期(PE)患者胎盘组织中的表达,并分析METTL3对人绒毛膜滋养层细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制。方法选择行剖宫产分娩的PE产妇15例、行剖宫产分娩的正常产妇15例。收集PE产妇及正常产妇胎盘组织,采用qRT-PCR法检测METTL3 mRNA表达水平。取人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo,分为空白对照组、空载对照组和过表达METTL3组,空白对照组正常培养,空载对照组感染阴性对照慢病毒,过表达METTL3组感染过表达METTL3慢病毒。采用CCK-8法观察三组细胞增殖能力,Tran⁃swell实验观察细胞迁移和侵袭能力,Western blotting法检测细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平。结果与正常产妇胎盘组织相比,PE产妇胎盘组织METTL3 mRNA表达水平升高(P均<0.01)。与空白对照组以及空载对照组相比,过表达METTL3组细胞增殖活力降低,细胞迁移数量、细胞侵袭数量减少,细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平降低(P均<0.01)。空白对照组与空载对照组上述指标比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论PE患者胎盘组织中METTL3表达升高;METTL3可能通过调控PI3K/AKT信号通路影响人绒毛膜滋养层细胞增殖、迁移和侵袭,从而参与PE的发生发展。

miR-30c-5p通过调节Notch1的表达抑制人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移、侵袭和管状形成

目的:探讨miR-30c-5p通过调节Notch1表达对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移、侵袭和管状形成调控的机制,确定其在子痫前期发病中的潜在作用。方法:在体外对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo进行培养,慢病毒系统构建miR-30c-5p过表达及敲低稳转HTR-8/SVneo细胞系。分为对照组、导入miR-30c-5p过表达质粒组和导入miR-30c-5p敲低质粒组。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-30c-5p和Notch1基因的表达量,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中Notch1蛋白的表达量,划痕愈合实验、Transwell侵袭实验和管状形成实验分别检测各组细胞的迁移、侵袭和管状形成能力。结果:与对照组比较,miR-30c-5p过表达质粒组中细胞的miR-30c-5p基因表达水平升高(P<0.0001),细胞Notch1蛋白表达水平下降(P<0.01),细胞迁移(P<0.01)、侵袭(P<0.001)和管状形成能力(P<0.05)均受到抑制。反之,miR-30c-5p敲低质粒组中细胞的miR-30c-5p基因表达水平下降(P<0.01),细胞Notch1蛋白表达升高(P<0.001),细胞的迁移(P<0.01)、侵袭(P<0.05)以及细胞的管状形成能力(P<0.01)增强。结论:miR-30c-5p能够通过抑制Notch1的表达降低人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移、侵袭和管状形成能力,参与子痫前期的发病。

HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的初步研究

目的检测HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的情况,为HBV宫内传播机制研究提供理论依据。方法用胰蛋白酶(0.25%)-DNase Ⅰ(0.15 U/ml)联合消化法,获取纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞。将状态良好的对数生长期人绒毛膜滋养层细胞分为6组,HBsAg-anti-HBs 复合物组(Ⅰ),热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清和高滴度anti-HBs阳性血清共同孵育物组(Ⅱ), 热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清组(Ⅲ),HBsAg组(Ⅳ),热灭活的正常人血清组(Ⅴ),及正常细胞培养液组(Ⅵ,空白对照组)。分别收集各组细胞铺片,免疫组化检测细胞的感染状况。结果所获人绒毛膜滋养层细胞纯度较高,符合后续实验要求。用鼠抗人anti-HBs免疫组化检测收集的细胞铺片,发现Ⅰ、Ⅱ组均有大量HBsAg阳性信号,Ⅲ组细胞亦有少量HBsAg阳性信号出现,其他各组细胞均未发现HBsAg阳性信号。结论体外培养的人胎盘滋养层细胞能将HBsAg-抗HBs复合物中的HBsAg,但不能将单独的HBsAg“摄入”胞内。

enJSRV囊膜蛋白及其受体的瞬时表达与绵羊绒毛膜滋养层细胞融合的诱导研究

旨在深入研究内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白在绵羊胎盘形成过程中的作用,本研究体外培养了蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞,采用RT-PCR技术扩增出enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因全长序列,定向克隆于真核表达载体pEGFP-C1上。优化绒毛膜滋养层细胞电转染条件和测定电转效率。将构建好的真核表达质粒分别电转染到绒毛膜滋养层细胞中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。并研究高表达enJSRV-env基因及通过RNA干扰沉默enJSRV-env基因对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合活性的影响。结果显示,真核表达质粒构建成功,分别命名为pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究表明,绵羊绒毛膜滋养层细胞最佳电转染条件为脉冲电压150 V,脉冲时间5.0 ms,电击2次,间隔50 ms。转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒及pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2共转染的绵羊绒毛膜滋养层细胞中多核细胞数目明显增加,平均每个视野分别可以观察到1.8和2.3个多核细胞。说明enJSRV-env对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合有一定的促进作用。本研究为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能及绒毛膜滋养层细胞融合机理提供试验基础。

重度子痫前期胎盘合体滋养细胞微绒毛膜脱落与Rho/ROCK分子表达的关系

目的探讨重度子痫前期(sPE)患者合体滋养细胞表面微绒毛膜(STBM)脱落水平与胎盘组织Rho/ROCK分子表达的关系。方法收集sPE产妇(sPE组)和正常产妇(对照组)胎盘组织各20例,透射电镜下观察胎盘合体滋养细胞表面微绒毛结构变化,应用体视学方法分析细胞表面微绒毛数密度(Nv)、表面积密度(Sv)和体积密度(Vv),通过Western blotting和免疫组化检测胎盘组织中Rho亚家族蛋白成员(RhoA、RhoB、RhoC)及Rho激酶(ROCKI、ROCKⅡ)的表达水平。应用Spearman等级相关分析法检验Rho、ROCK蛋白表达水平与STBM脱落水平的相关性。结果 sPE组患者胎盘合体滋养细胞表面微绒毛的Nv、Sv、Vv均显著小于对照组(P<0.05),胎盘组织中RhoA、RhoB、ROCKI、ROCKⅡ蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。sPE组患者胎盘组织中RhoB、ROCKI、ROCKⅡ的表达水平与STBM的脱落水平均呈正相关(r=0.631,r=0.826,r=0.865,P<0.05)。结论 RhoB及其与下游分子ROCKI、ROCKⅡ构成的信号通路可能在sPE时胎盘STBM脱落过程中发挥重要作用。

小鼠合体滋养细胞微绒毛膜制备方法的研究

目的建立一种制备小鼠合体滋养细胞微绒毛膜(STBM)的方法。方法收集足月孕小鼠的胎盘,利用机械分离法剪碎胎盘进行差速离心,分离小鼠STBM。用Lowry法测定制备的小鼠STBM蛋白水平,用组织多肽抗原作为小鼠STBM的标记物,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测STBM的水平,利用电镜观察并分析小鼠STBM的形态结构。结果实验获得的小鼠STBM制剂的蛋白水平为(0.69±0.12)mg/mL,TPA水平为(61.49±9.78)ng/mL。电镜下小鼠STBM的直径为(228.52±90.06)nm的囊泡状结构。结论制备的小鼠STBM与人STBM高度相似,可为子痫前期致病机制的探索提供在体研究的实验基础。

人绒毛膜滋养层细胞的体外培养

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织 ,进行原代培养 ,胰蛋白酶消化法传代培养 ,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果 原代培养滋养层细胞 3h后开始贴壁 ,18h后全部贴壁 ,3天可传代 ,角蛋白、波形蛋白染色细胞纯度达 95 %以上。结论 胰蛋白酶、胶原酶消化法简便易行 ,可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞 ,建立了稳定的人类绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。

合体滋养细胞微绒毛膜与子痫前期

子痫前期是严重危害母儿健康的产科常见病,是导致孕产妇和围生儿发病率和死亡率升高的主要原因之一,其病因至今未明。近年来合体滋养细胞微绒毛膜(STBM)与子痫前期发病密切相关得到重视,合体滋养细胞微绒毛膜是胎盘合体滋养细胞碎片脱落进入母体血循环后形成的,可经多种途径损害母体血管内皮细胞,影响母体自身免疫系统,从而在子痫前期的发病中起重要作用。就合体滋养细胞微绒毛膜与子痫前期的关系综述。

miR-130b-5p下调胰岛素样生长因子-1抑制人绒毛膜滋养层细胞迁移及侵袭的作用及机制

【目的】探究微小RNA 130b-5p(miR-130b-5p)靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)迁移及侵袭的影响。【方法】将HTR8/SVneo细胞分为对照组、miR-NC组、miR-130b-5pmimics组、miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1组和miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1组,双荧光素酶报告基因检测miR-130b-5p和IGF-1的靶向关系;采用实时荧光定量PCR检测HTR8/SVneo细胞样本中miR-130b-5p及IGF-1表达水平;采用CCK-8法检测HTR8/SVneo细胞增殖情况;采用全息细胞仪及Transwell法分析HTR8/SVneo细胞迁移、侵袭能力;Western blot法检测HTR8/SVneo细胞样本中IGF-1及侵袭、上皮间充质转化(EMT)蛋白表达情况。【结果】双荧光素酶报告基因结果显示,IGF-1是miR-130b-5p的潜在靶基因;相较于miR-NC组,miR-130b-5pmimics组中miR-130b-5p表达水平、细胞增殖抑制率、钙粘附蛋白E(E-cadherin)表达水平显著增加,IGF-1、c-Myc、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达水平、迁移距离、侵袭细胞数、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平显著降低(P<0.05);相较于miR-130b-5pmimics+pcD⁃NA3.1组,miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1组中细胞增殖抑制率、E-cadherin表达水平显著降低,c-Myc、Cy⁃clinD1表达水平、迁移距离、侵袭细胞数、MMP9、MMP2、Vimentin和N-cadherin表达水平显著增加(P<0.05)。【结论】miR-130b-5p过表达可能通过抑制IGF-1表达来抑制HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭。

吗啡对人早孕绒毛膜滋养层细胞μ阿片受体mRNA表达的影响

全球性的药物滥用和药物依赖已经成为当前社会最受关注的问题，其中吸毒人数的不断增加，尤其是女性吸毒者的绝对数和相对数大幅度的增加给社会、家庭和个人带来了极大的危害。几乎90％的吸毒女性是处于生育期，吸毒不仅危害自身健康。而且毒品还可以通过胎盘影响胎儿及新生儿，导致胎儿宫内窘迫、窒息，早产儿、新生儿戒断综合征等。

分散人绒毛膜滋养层细胞及细胞培养

目的 获取人绒毛膜滋养层细胞。方法 应用胰酶 /DNA酶法进行消化后进行培养。经光镜和电镜观察。结果 我们获取了人绒毛滋养层细胞并成功培养。结论 取人妊娠 4 5～ 5 5D刮宫术后的绒毛组织 ,经胰酶。

绵羊绒毛膜滋养层细胞与子宫内膜腔上皮细胞共培养体系的建立

本研究旨在探索绵羊绒毛膜滋养层细胞(sheep trophoblast cells, STCs)和子宫内膜腔上皮细胞(endometrial luminal epithelial cells, ELECs)的共培养条件,为绵羊胎盘绒毛膜滋养层多核细胞的形成提供试验依据。在屠宰场采集妊娠45～60 d的健康绵羊子宫及胎盘组织,用酶消化法体外分离培养STCs和ELECs,并进行细胞免疫荧光鉴定,同时利用姬姆萨氏染色法确定STCs和ELECs最佳的共培养条件;然后转染空质粒pEGFP-C1到ELECs 48 h后,与STCs共培养,并利用激光共聚焦显微镜观察滋养层多核细胞的形态。结果显示:STCs CK-7与ELECs CK-18均呈阳性;当STCs与ELECs细胞数量比值为2∶1,共培养48 h,多核细胞数量最多,且与对照组相比差异显著(P<0.05);CK-7在STCs中表达呈红色荧光,且细胞中有pEGFP-C1标记的绿色荧光,胞核蓝染,3种荧光共表达呈现出了白光。综上表明,本研究建立了STCs和ELECs共培养条件,ELECs参与绵羊滋养层多核细胞的形成。

PSMB8在人绒毛膜滋养层细胞中对细胞凋亡和自噬的影响

目的初步探讨蛋白酶体亚基PSMB8(proteasome subunit beta 8)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/Svneo)凋亡及自噬的影响。方法将HTR-8细胞分为转染组和对照组,采用瞬时转染的方法分别将PSMB8 siRNA-1、PSMB8 siRNA-2转入转染组中,将NC siRNA转入对照组中。转染48h后用qRT-PCR进行干涉效率验证,CCK-8检测细胞增殖情况,TUNEL和流式细胞术分析细胞凋亡情况,免疫荧光染色检测细胞内caspase-3(cleaved)和LC3蛋白的表达,qRT-PCR检测细胞中自噬相关基因mRNA表达水平。结果qRT-PCR结果显示,PSMB8 siRNA-1组干扰效果较好。与对照组比较,PSMB8 siRNA-1组细胞增殖能力减弱,HTR-8细胞中TUNEL(15.05±2.62 vs 33.40±2.44,P=0.000)和caspase-3(cleaved)(21.70±5.87 vs 53.29±10.29,P<0.01)阳性率增加。流式结果显示,与对照组比较,PSMB8 siRNA-1组存活细胞比例减少(89.10±0.78 vs 77.00±1.68,P=0.000),早期凋亡和晚期凋亡细胞比例增加(9.09±0.65 vs 10.71±0.61,P<0.05),坏死细胞比例也增加(2.49±0.73 vs 12.49±2.02,P<0.01)。与对照组比较,PSMB8 siRNA-1组LC3蛋白阳性细胞率增加(19.02±3.78 vs 31.90±4.87,P<0.05),各自噬相关基因mRNA相对表达水平均上调。结论在HTR-8细胞中沉默PSMB8基因表达可以诱导细胞凋亡并且激活自噬。