苯并咪唑衍生的单核钴(Ⅱ)和单核镍(Ⅱ)配合物与DNA和蛋白质的结合反应性及细胞毒活性研究

利用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱（CD）等各种光谱手段对比地研究了由苯并咪唑衍生的单核钴配合物[Co（EDTB）]^2＋（1）和单核镍配合物[Ni（EDTB）]^2＋（2）（这里EDTB为N,N,N’，N’-四（2’-苯并咪唑甲基）-1，2-乙二胺）与小牛胸腺DNA（CT-DNA）和牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。结果表明，在生理条件下，配合物1和2均能通过插入方式较强的与CT-DNA结合，诱导DNA构象的改变；且配合物1对DNA的结合能力略强于2，其结合常数分别为Kb（I）=3．23×10^4L·mol^-1和Kb（2）=2．40×10^4L·mol^-1。配合物与BSA相互作用的研究表明，1和2均能与BSA发生较强的相互作用，结合常数均处在10^4-10^5L·mol^-1；该结合引起了BSA微环境和构象发生变化．且使BSA内源荧光被淬灭．淬灭机理为静态淬灭。利用MTT法研究了配合物1和2对小鼠白血病细胞株P388和人非小细胞肺癌细胞株A-549的体外细胞毒活性．实验结果表明，配合物1和2对P388不敏感．对A-549在高浓度（10^-4～10^-5 mol·L^-1）下表现出与顺铂相当的细胞毒活性。

奥氮平介导环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子/酪氨酸蛋白激酶受体B通路对精神分裂模型大鼠的神经修复作用

目的 探讨奥氮平通过对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)通路的影响对精神分裂模型大鼠的神经修复作用。方法 将60只大鼠纳入对照组、模型组、奥氮平低、中、高剂量组,各组均10只。模型组、奥氮平低、中、高剂量组大鼠进行MK-801腹腔注射0.2 mg/(kg·d),对照组注射等量生理盐水。模型建立成功24 h后,奥氮平低、中、高剂量组分别以0.5、1.0、1.5 mg/(kg·d)奥氮平溶液灌胃,对照组、模型组同剂量生理盐水灌胃。按照共济失调和刻板行为标准对大鼠行为学进行评分;Morris水迷宫实验评定大鼠认知功能及学习能力;ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平;观察海马组织病理学变化;检测海马区细胞凋亡及CREB/BDNF/TrkB通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠共济失调、刻板行为评分、TNF-α、IL-6表达、细胞凋亡率极显著增加(P<0.01),奥氮平低、中剂量组显著增加(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠跨越平台次数、目标象限停留时间、CREB、磷酸化CREB(p-CREB)、磷酸化TrkB(p-TrkB)、TrkB、BDNF蛋白相对表达极显著减少(P<0.01),奥氮平低、中剂量组显著减少(P<0.05)。与模型组比较,奥氮平低、中剂量组跨越平台次数、目标象限停留时间显著增加(P<0.05),奥氮平高剂量组极显著增加(P<0.01)。模型组以及奥氮平低剂量组中海马细胞肿大明显、细胞核破碎分裂、固缩,组织排列杂乱;奥氮平中、高剂量组大鼠海马细胞中少见破碎分裂以及核固缩现象,整体组织与对照组大鼠相似。结论 奥氮平对精神分裂症模型大鼠的神经修复作用机制涉及到改善大鼠认知功能受损、保护大鼠海马神经细胞以及激活CREB/BDNF/TrkB信号通路的表达。

牙髓干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤新生大鼠远期行为学及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的变化

背景:环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)是影响记忆存储的关键蛋白,与长期记忆密切相关,研究牙髓干细胞侧脑室移植远期行为学及CREB的变化机制可为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供新思路。目的:观察人牙髓干细胞移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠远期行为学以及CREB表达的影响,为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供科学的理论依据。方法:36只健康7 d龄SD大鼠随机等分为正常组、缺氧缺血性脑损伤组和人牙髓干细胞组。采用经典的Rice法建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型,造模后24 h后,人牙髓干细胞组经侧脑室注入2μL人牙髓干细胞(浓度为1.5×106μL-1),正常组和缺氧缺血性脑损伤组分别注射等量生理盐水。结果与结论:人牙髓干细胞组大鼠平均觅水时间、平均逃避潜伏期及平均逃避距离亦显著短于缺氧缺血性脑损伤组(P<0.01),但其平均觅水时间、逃避潜伏期及距离均长于正常组(P<0.01);尼氏染色结果示人牙髓干细胞组海马CA1区细胞排列较规则,细胞数量较多,显著多于缺氧缺血性脑损伤组,但仍少于正常组(P<0.05);免疫组织化学染色结果示人牙髓干细胞组CREB阳性细胞数亦显著多于缺氧缺血性脑损伤组,但仍显著少于正常组(P<0.01)。提示人牙髓干细胞移植可通过促进海马CA1区CREB的表达,改善缺氧缺血性脑损伤新生大鼠远期学习记忆能力,从而修复新生大鼠缺氧缺血性脑损伤。

柴胡疏肝散调节大鼠额叶环磷酸腺苷/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子信号通路发挥抗抑郁作用研究

目的基于环磷酸腺苷/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子(cAMP/CREB/BDNF)信号转导通路信号通路探讨柴胡疏肝散抗抑郁的可能机制。方法2017年1月至2018年10月,采用随机数字表法将实验大鼠分为空白组、模型组、艾司西酞普兰组和柴胡疏肝散组,除空白组外,其他各组采用慢性不可预知温和应激制定抑郁症模型。用蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和旷场实验实验评价柴胡疏肝散抗抑郁的作用。用尼氏染色观察大鼠前额叶皮层区病理形态变化。用Real time PCR和蛋白质印迹法检测大鼠前额叶皮层中cAMP、CREB、BDNF的基因和蛋白表达水平。结果给药后,与模型组比较,柴胡疏肝散大鼠糖水偏好率有所增加[(60.75±15.63)%比(77.39±18.39)%,P=0.031],而大鼠强迫游泳不动时间[(64.39±10.62)s比(47.93±18.71)s,P=0.012],均差异有统计学意义(P<0.05)。柴胡疏肝散组大鼠运动距离[(400.29±40.24)cm比(502.59±36.13)cm]和穿越中央区域次数[(11.56±4.92)比(15.68±3.56)]增加(P=0.000,P=0.011),静止时间[(83.55±13.87)s比(66.75±16.15)s,P=0.028],均差异有统计学意义。尼氏染色显示柴胡疏肝散组大鼠皮层尼氏体固缩和深染减轻,树突减少情况好转。柴胡疏肝散组大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF mRNA(0.53±0.16、0.79±0.15、0.64±0.26)表达水平升高(0.37±0.16、0.43±0.18、0.40±0.13)(P=0.024,P=0.000,P=0.000),均差异有统计学意义。柴胡疏肝散组大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF蛋白(0.47±0.27、0.59±0.11、0.58±0.15)表达水平升高(0.28±0.13、0.41±0.15、0.43±0.11)(P=0.000,P=0.027,P=0.022)。结论柴胡疏肝散具有抗抑郁的作用,其机制可能与其上调cAMP/CREB/BDNF信号通路有关。

糖尿病大鼠脑组织环磷酸腺苷反应元件结合蛋白及β-淀粉样蛋白的表达及意义

目的:分析糖尿病大鼠认知行为学改变与脑组织β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP responseelement binding protein,CREB)及磷酸化CREB(phosphorylated CREB,pCREB)表达变化的相关性,为探讨糖尿病糖代谢异常在阿尔茨海默病发病中的作用机制奠定基础。方法:腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱发糖尿病大鼠动物模型,随机分为4周模型组(M4组)、6周模型组(M6组)、8周模型组(M8组),以同批未制模大鼠作为正常对照(N组)。穿梭箱实验、Morris水迷宫实验检测认知行为学改变,刚果红染色检测大鼠脑内淀粉样物质沉着,Western印迹法、酶联免疫吸附法和RT-PCR检测大鼠脑组织CREB与pCREB的表达,酶联免疫吸附法检测脑组织Aβ表达。结果:行为学检测显示模型组大鼠有显著的认知功能障碍,模型组与正常对照组比较有明显差异(P<0.01);模型组Aβ表达明显增高(P<0.01),模型组CREB与pCREB表达明显降低(P<0.01),而3个模型组比较无统计学差异;Aβ表达水平与CREB、pCREB表达水平负相关,Aβ与学习、记忆损伤正相关,CREB、pCREB与学习、记忆损伤负相关。结论:糖尿病糖代谢异常可能通过下调脑组织CREB、pCREB表达及增强Aβ表达诱发脑损伤,导致认知行为改变。

外源CRE顺式元件对慢性吗啡作用SK-N-SH细胞CREB蛋白表达及DNA结合活性的影响

目的: 研究以cAMP反应元件结合蛋白 (cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)为靶点的CREB转录因子诱骗 (CRE transcriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide、CRE decoyODN)对慢性吗啡作用SK N SH细胞CREB相关指标的影响.方法: 体外合成含cAMP反应元件 (cAMPresponseelement,CRE)的单链寡核苷酸,以DOTAP为转移介质,将CRE decoyODN与慢性吗啡作用和纳络酮催促戒断的SK N SH细胞共同孵育,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影检测CRE decoyODN细胞掺入;EMSA检测CRE decoyODN与转录因子CREB结合的特异性以及其对慢性吗啡作用SK N SH细胞CREB的DNA结合活性影响;WesternBlot检测CREB 1及磷酸化CREB 1蛋白表达.结果: 以DOT AP为介质,将CRE decoyODN成功导入SK N SH细胞;慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断使SK N SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1 蛋白表达明显增高 (P值均<0 01),CREB 1蛋白无明显改变,CRE decoyODN可抑制CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1蛋白表达的改变(P<0 01),对CREB 1蛋白表达无明显影响.结论: CRE de coyODN可特异抑制慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断SK N SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1蛋白表达的增高,对CREB 1蛋白表达无明显影响.

海马注射脑源性神经营养因子对大鼠脑卒中后抑郁的作用及机制

目的观察海马内注射脑源性神经营养因子(BDNF)对大鼠脑卒中后抑郁的改善作用,并探究其对环磷酸腺苷/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子(cAMP/CREB/BDNF)信号通路的影响。方法2022年1―3月选择SPF级SD雄性大鼠95只,采用随机数字表法选择80只制备脑卒中后抑郁(PSD)模型,余15只为假手术组。将PSD造模成功的64只大鼠采用随机数字表法分为PSD组、无序干扰组、BDNF干预组、激活剂组和抑制剂组。造模成功2 h后,给予无序干扰组和BDNF组大鼠分别注射含无序干扰序列的慢病毒载体和含BDNF的慢病毒载体,激活剂组和抑制剂组分别给予皮下注射forskolin和SQ22536,假手术组和PSD组注射等量含5%二甲基亚砜的生理盐水。采用糖水实验和敞箱实验评估大鼠抑郁情况,采用实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测各组海马组织BDNF相对表达水平,苏木精-伊红(HE)染色观察海马组织病理学变化,测定各组大鼠海马组织去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)含量,蛋白质印迹法(Western blotting)检测海马区cAMP、pCREB、BDNF蛋白表达水平。结果与假手术组比较,PSD组、无序干扰组、BDNF组糖水消耗量[(42.69±2.18)%、(42.84±2.29)%、(71.66±3.04)%比(90.34±3.28)%]、方格穿行次数[(13.72±0.97)次、(13.98±0.75)次、(23.17±1.47)次比(39.66±1.45)次]和竖起修饰次数[(9.14±0.45)次、(9.52±0.53)次、(12.96±0.75)次比(18.65±1.12)次]减少,BDNF相对表达量(0.62±0.13、0.69±0.09、1.68±0.16比2.62±0.32)降低,且BDNF组高于PSD组和无序干扰组(P<0.05);HE染色结果显示,PSD组和无序干扰组海马神经元细胞形态相似,数目减少,排列紊乱;BDNF组海马神经元细胞数目增加,排列基本紧密,形态基本规则;与假手术组比较,PSD组、无序干扰组、BDNF组NE、5-HT水平降低,且BDNF组高于PSD组和无序干扰组(P<0.05)。与假手术组比较,PSD组、无序干扰组、BDNF组、抑制剂组和激活剂组cAMP、pCREB、BDNF水平降低,且BDNF组和激活剂组>PSD组、无序干扰组和抑制剂组(P<0.05)。结论海马内注射BDNF对大鼠PSD症状、海马神经元病理均有改善作用,其作用机制可能与激活cAMP/CREB/BDNF通路有关。

CREB_1蛋白在大鼠急、慢性吗啡依赖和戒断中的表达变化

目的研究急、慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)的表达调节作用。方法雄性SD大鼠36只,随机分为急性对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组,每组6只。采用免疫组化方法测定不同脑区和核团CREB1蛋白表达水平。结果急性吗啡依赖和戒断抑制蓝斑CREB1蛋白表达。慢性吗啡依赖和戒断增加皮质、海马、蓝斑等脑区核团CREB1蛋白的表达,但是在慢性吗啡依赖和戒断时,伏隔核CREB1蛋白表达下降。结论急、慢性吗啡依赖和戒断时CREB1在大鼠皮质、海马、下丘脑、蓝斑、伏隔核等脑区的表达存在差异,可能与介导阿片类药物依赖信号转道通路的反应性不同有关。

纹状体边缘区学习记忆相关抑制性信号转导过程与蛋白磷酸酶1的参与作用

目的:明确蛋白磷酸酶1抑制剂岗田酸对大鼠纹状体边缘区相关的学习记忆的作用。方法:实验于2004-03/08在南方医科大学珠江医院神经生物研究室进行,选取成年SD大鼠35只,经Y迷宫训练筛选合格动物28只,随机分为正常对照组(n=6)、正常训练组(n=7)、岗田酸组(n=8)、生理盐水组(n=7)4组。正常对照组大鼠不接受任何训练,其余各组大鼠在Y迷宫中接受3d厌暗逃避反射训练,3d后岗田酸组双侧侧脑室分别缓慢注射岗田酸0.8μL(40g/L),生理盐水组注射等容积生理盐水。采用免疫组织化学染色观察了纹状体边缘区蛋白磷酸酶1、磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白表达的改变。结果:28只大鼠进入结果分析。各组大鼠边缘区均有蛋白磷酸酶1表达,且正常对照组与正常训练组脑内边缘区蛋白磷酸酶1表达无明显差别(47.33±3.33,46.38±2.77,P=0.567);正常训练组边缘区有磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白表达而正常对照组边缘区无表达;岗田酸组在术后12h边缘区仍有磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白表达而生理盐水组则已经无表达。结论:纹状体边缘区学习行为相关蛋白转录调节中有蛋白磷酸酶1的参与。

跑台运动对血管痴呆大鼠学习记忆的影响及其作用机制

目的 观察4周低强度跑台运动对血管痴呆(VD)大鼠空间学习记忆能力,前额叶皮质(PFC)氨基酸水平及蛋白激酶A(PKA)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路蛋白表达的影响。方法 39只SD大鼠随机分为假手术组(sham,n=13)、血管痴呆组(VD,n=13)及血管痴呆运动组(VD+EX,n=13)。VD组及VD+EX组大鼠采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备慢性脑缺血大鼠模型,然后VD+EX组大鼠进行4周低强度跑台运动。运动结束后,利用水迷宫实验(MWM)评估大鼠学习记忆能力,高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠PFC区神经递质谷氨酸(Glu)及γ-氨基丁酸(GABA)水平,利用Western blotting检测大鼠PFC组织PKA、CREB及BDNF蛋白表达。结果 MWM实验结果显示,VD组大鼠第1~5天平均逃避潜伏期较假手术组显著增加,初次找到原平台时间延长,穿越平台次数显著下降(P<0.01)。经过4周低强度跑台运动,VD+EX组大鼠第1~5天平均逃避潜伏期较VD组显著下降,初次找到原平台时间缩短,穿越平台次数显著增加(P<0.01,P<0.05)。HPLC及Western blotting检测显示,与sham组比较,VD组大鼠PFC区Glu、GABA水平及PFC组织PKA、CREB及BDNF蛋白表达均显著下降(P<0.01);与VD组大鼠比较,VD+EX组大鼠PFC区Glu水平及PFC组织PKA、CREB及BDNF蛋白表达均显著增加(P<0.01,P<0.05),GABA水平两组之间差异无显著性(P>0.05)。结论 4周低强度跑台运动可通过增加VD大鼠Glu的释放,并激活PKA/CREB/BDNF通路提升PFC区BDNF表达,从而改善VD大鼠的学习记忆能力。

豨莶草总黄酮对癫痫大鼠海马神经元损伤及CREB/BDNF信号通路的影响

目的探究豨莶草总黄酮对癫痫大鼠海马神经元的保护作用及对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路的影响。方法将SD大鼠随机分成5组:对照组、模型组及豨莶草总黄酮低、中、高剂量组。除对照组外,其余各组均采用锂-毛果芸香碱诱导构建癫痫持续状态(SE)大鼠模型。造模成功后,豨莶草总黄酮低、中、高剂量组大鼠给予5、10、20 mg/kg的剂量连续4 w灌胃治疗。治疗结束后,根据Racine分级标准对各组大鼠行为学进行评估;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测海马组织中白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察海马组织病理变化;TUNEL染色检测海马神经元细胞凋亡情况;Western印迹法检测海马组织中CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达水平。结果对照组海马组织结构正常,模型组神经元损伤明显,豨莶草各剂量组神经元损伤减轻,以高剂量组最为明显。与对照组相比,模型组大鼠行为学评分、神经元凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA及BDNF蛋白表达水平显著升高(P<0.05),SOD、GSH-Px、p-CREB蛋白水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,豨莶草总黄酮各剂量组行为学评分、神经元凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA水平显著降低(P<0.05),SOD、GSH-Px、p-CREB和BDNF蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论豨莶草总黄酮可减轻SE大鼠的炎症反应和氧化应激,抑制神经元凋亡,可能与激活CREB/BDNF信号通路有关。

丙泊酚调控cAMP/PKA-CREB-BDNF通路对大鼠神经元凋亡、坐骨神经阻滞效果的影响

目的分析丙泊酚调控脊髓环磷酸腺苷/蛋白激酶A-磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白-脑源性神经营养因子(cAMP/PKA-CREB-BDNF)通路对大鼠神经元凋亡、坐骨神经阻滞效果的影响。方法选取40只SPF级Wistar雄性大鼠,其中对照组、假手术组、低剂量组、高剂量组各10只,空白组不做任何处理,假手术组进行手术处理和0.9%氯化钠溶液注射,低剂量组在假手术的基础上注射丙泊酚10 mg/kg;高剂量组注射丙泊酚30 mg/kg。结果与空白组相比,假手术组、低剂量组、高剂量组SOD活性降低(P<0.05);MDA含量、海马神经元凋亡率、各时间点MPE、MPE均升高以及cAMP、PKA、CREB、BDNF表达均降低(P<0.05)。与假手术组相比,低剂量组、高剂量组MDA含量降低(P<0.05);SOD活性、海马神经元凋亡率、各时间点MPE以及10、20、30、60、90、120 min时间点MPE均升高、150、180 min时间点MPE均降低(P<0.05);cAMP、PKA、CREB、BDNF表达均降低(P<0.05)。与低剂量组相比,高剂量组MDA含量降低(P<0.05);SOD活性、海马神经元凋亡率、各时间点MPE以及150、180min时间点EPT均升高;10、20、30、60、90、120 min时间点EPT均降低,(P<0.05);cAMP、PKA、CREB、BDNF表达均降低(P<0.05)。结论丙泊酚能够增强坐骨神经阻滞效果,降低神经元凋亡率,起保护作用可能与丙泊酚调控cAMP/PKA-CREB-BDNF通路有关。

富血小板血浆促糖尿病创面愈合机制的初步研究

目的探讨富血小板血浆(PRP)促进糖尿病创面愈合与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP3)炎性反应复合物/IL-1β信号通路的关系。方法共收集25份组织标本,5份取自5例糖尿病截肢患者截下肢体的远端坏死交界区(DMD组),5份取自前述5例糖尿病截肢患者截下肢体的近端创面(DMP组),5份取自5例非糖尿病截肢患者截下肢体的近端创面(NDM组),5份取自5例糖尿病足溃疡保肢治疗患者的溃疡创面使用PRP治疗前行清创时去除的组织(NPRP组),5份取自前述5例糖尿病足溃疡保肢治疗患者的溃疡创面使用PRP治疗后首次行清创时去除的组织(PRP组)。分别采用Western印迹法检测NIRP3蛋白表达,ELISA检测IL-1β蛋白表达,实时荧光定量PCR检测NLRP3基因和IL-1β基因表达。结果 DMD组和DMP组的IL广1β和NLRP3蛋白相对表达量和基因相对表达量均显著高于NDM组(P值均<0.05),DMP组的IL-1β和NIRP3蛋白相对表达量和基因表达量均显著高于DMD组(P值均<0.05)。NPRP组的IL-1β和NLRP3蛋白相对表达量和基因相对表达量均显著高于PRP组(P值均<0.05)。结论 NLRP3炎性反应复合物/IL-1β信号通路上调可阻碍糖尿病创面的愈合。PRP通过抑制NLRP3炎性反应复合物/IL-1β信号通路,加快糖尿病创面愈合进程,是其促进糖尿病创面愈合的机制之一。

干扰TonEBP基因对Raw264.7细胞迁移、增殖和吞噬功能的影响

目的探讨张力反应性增强因子结合蛋白(tonicity-responsive enhancer binding protein,TonEBP)基因对巨噬细胞活性、迁移、增殖及吞噬功能的影响。方法利用TonEBP-shRNA慢病毒感染Raw 264.7细胞,筛选稳定细胞株,Real time-PCR、Western blot评估干扰效率,选取干扰效率最高的慢病毒感染组及空载慢病毒感染组用于后续实验。各组细胞同步培养,孵育24 h后CCK-8法测定细胞活性,transwell实验观察细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞周期及吞噬功能。结果成功建立并筛选出干扰TonEBP稳定细胞株,与正常细胞组相比,mRNA和蛋白的干扰效率均高于70%,差异具有统计学意义(P<0.05);下调TonEBP表达可使细胞活性明显下降[24 h(0.39±0.02 vs 0.46±0.01),48 h(0.57±0.02 vs 0.63±0.02),72 h(0.71±0.02 vs 1.01±0.11),96 h(0.93±0.06 vs 1.42±0.04),120 h(1.26±0.06 vs 1.56±0.09)](P<0.05),同时显著降低细胞迁移(88±7.00 vs 356±35.23)、增殖[(38.73±2.57)%vs(50.20±2.29)%]及吞噬[(2.26±0.10)%vs(5.63±0.42)%]能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论干扰TonEBP的表达可有效抑制巨噬细胞活性,降低其迁移、增殖及吞噬能力,为继续探究与巨噬细胞相关的疾病提供实验依据。

积雪草酸调节cAMP/CREB/BDNF信号通路对七氟醚诱导的新生大鼠神经毒性的影响

目的探究积雪草酸(AA)调节环磷酸腺苷(cAMP)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路对七氟醚诱导的新生大鼠神经毒性的影响。方法将SD大鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(Model组)、AA低剂量组(AA-L组,10 mg/kg)、AA高剂量组(AA-H组,20 mg/kg)和AA高剂量+cAMP抑制剂SQ22536组(AA-H+SQ22536组,AA 20 mg/kg+2.22 mg/kg SQ22536)。Y迷宫实验、Morris水迷宫实验检测大鼠的空间认知能力。酶联免疫吸附实验法(ELISA)测定大鼠血清和海马组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)和丙二醛(MDA)的水平和海马组织中cAMP含量。TUNEL法检测大鼠海马组织神经细胞凋亡。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测大鼠海马组织中CREB、BDNFmRNA的表达;Westernblot检测大鼠海马组织中p-CREB、BDNF蛋白的表达。结果与Control组相比,Model组大鼠海马组织神经细胞凋亡率、第4、5天的逃逸潜伏期、血清和海马组织中MDA水平显著增加(P<0.05);交替得分率、目标象限停留时间、血清和海马组织中SOD、GSH-px水平、海马组织CREB、BDNF mRNA表达水平和cAMP、p-CREB和BDNF蛋白表达水平显著减少(P<0.05)。与Model组相比,AA-H组大鼠相应指标变化趋势与上述相反。SQ22536减弱了AA对七氟醚诱导的新生大鼠神经毒性的抑制作用。结论AA可能通过上调cAMP/CREB/BDNF信号通路减轻七氟醚诱导的新生大鼠神经毒性。

慢性神经病理性疼痛大鼠背根神经节和脊髓背角pCREB表达的变化

目的探讨背根神经节和脊髓背角磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB)表达在慢性压迫性神经损伤(CCI)致神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏中的作用。方法成年雌性SD大鼠32只, 体重230-270 g,随机分为4组(n=8):空白组、sham组、CCI 2w组和CCI 4w组。CCI前测定痛阈[机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)]基础值,CCI后(空白组、sham组和CCI 2w组于 CCI 14 d;CCI 4w组于CCI 28 d)再次测定痛阈。最后一次测定痛阈后次日,取k4,5脊髓和L5背根神经节,免疫组织化学染色,计数pCREB免疫反应阳性(pCREB-IR)神经细胞数量。结果 MWT:CCI后 sham组、CCI 2w组、CCI 4w组均低于基础值,CCI后sham组低于空白组,CCI 2w组低于sham组(P< 0．01);TWL:CCI 2w组短于基础值,CCI 2w组短于sham组,CCI后CCI 4w组长于CCI 2w组(P<0.01)。 sham组背根神经节pCREB-IR神经细胞数量多于空白组,CCI 2w组背根神经节及脊髓背角pCREB-IR 神经细胞数量多于sham组,CCI 4w组背根神经节及脊髓背角pCREB-IR神经细胞数量少于CCI 2w组 (P<0．05或0．01)。结论 CCI致慢性神经病理性疼痛大鼠背根神经节和脊髓背角pCREB表达增加,这可能是外周神经损伤后中枢和外周敏感化的分子机制。

鞘内注射DREAM—shRNA对神经病理性痛大鼠脊髓背角p-CREB表达的影响

目的探讨鞘内注射转录因子下游调控元件拮抗因子．短发夹RNA（DREAM-shRNA）对神经病理性痛大鼠脊髓背角磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）表达的影响。方法成年健康雄性SD大鼠，体重280～320g，采用坐骨神经慢性压迫（CCI）法建立大鼠神经病理性痛模型。于CCI后第3天鞘内置管。取鞘内置管成功的大鼠24只，随机分为4组，每组6只，假手术组（S组）：仅暴露坐骨神经，不结扎；神经病理性痛组（NP组）：于CCI后第8天鞘内注射生理盐水10出；RNA干扰组（RNAi组）：于CCI后第8天鞘内注射DREAM—shRNA5μl和生理盐水5μl；空白载体组（BV组）：于CCI后第8天鞘内注射慢病毒空白载体5μl和生理盐水5μl，各组连续注射7d。于CCI前1d（T0，基础状态）、CCI后第7～14天（T1-8）时测定机械痛阈。于CCI后第15天时测定脊髓背角绿色荧光蛋白（GFP）和p-CREB的表达水平。结果与基础值比较，各组各时点机械痛阈降低（P〈0．05或0．01）；与T1时比较，NP组和BV组T5-8时机械痛阈降低，RNAi组B时机械痛阈升高（P〈0．05或0．01）；与S组比较，NP组和BV组机械痛阈降低，RNAi组R时机械痛阈降低，B时升高，NP组、RNAi组和BV组脊髓背角p-CREB达上调（P〈0．05）；与NP组比较，RNAi组T6-8时机械痛阈升高，脊髓背角p-CREB表达下调（P〈0．05）。RNAi组脊髓背角可见大量绿色荧光，即GFP表达阳性，其余3组脊髓背角未见绿色荧光，即GFP无表达。结论鞘内注射DREAM—shRNA缓解大鼠神经病理性痛的机制可能与抑制脊髓背角p-CREB的表达有关。

急性或慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织CREB-1表达的影响

目的研究急性或慢性吗啡依赖和戒断大鼠脑组织环腺苷酸反应元件结合蛋白-1 (CREB-1)表达的变化。方法雄性SD大鼠30只,随机分为5组(n=6):空白对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组。急性吗啡依赖组每次背部皮下注射吗啡5 mg/kg,间隔2 h,连续8次;急性吗啡戒断组在急性吗啡依赖后3 h腹腔注射纳洛酮5 mg／kg,催促戒断30 min后处死大鼠。慢性吗啡依赖组每日吗啡用量分3次腹腔注射,从第一天用量5 mg/kg起,直到第12天递增至260 mg／kg,慢性吗啡戒断组在慢性吗啡依赖后的次日腹腔注射纳洛酮5 mg/kg,催促戒断24h后处死大鼠。用Western-blot法测定大脑皮层、伏隔核及海马CREB-1表达。结果与空白对照组比较,急性吗啡依赖、戒断组皮层、伏隔核和海马CREB-1表达差异无统计学意义(P>0．05),慢性吗啡依赖、戒断组皮层、海马CREB-1表达上调,伏隔核CREB-1表达下调(P<0．05);与慢性吗啡依赖组比较,慢性吗啡戒断组伏隔核CREB-1表达下调(P<0．05)。结论急性吗啡依赖、戒断对脑组织CREB-1表达无影响;而慢性吗啡依赖、戒断后不同脑区CREB-1表达不同。

侧脑室注射 ERK5的反义寡核苷酸对小鼠神经病理性痛的作用

目的：探讨脊髓上水平的细胞外信号调节蛋白激酶5（ ERK5）信号通路在慢性坐骨神经结扎（ CCI ）致神经病理性疼痛中的作用。方法制作CCI神经病理性疼痛模型，应用侧脑室注射反义寡核苷酸技术和免疫组织化学标记技术，应用von Frey机械痛敏检测仪和热辐射痛敏检测仪，检测鞘内注射ERK5反义寡核苷酸对神经病理性疼痛小鼠机械缩足反射阈值（ MWT ）和热缩足反射潜伏期（ TWL ）、脊髓磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（ CREB ）表达的影响。结果 CCI致神经病理性疼痛刺激后，小鼠患侧后足机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期均明显降低；侧脑室注射ERK5反义寡核苷酸，与错义寡核苷酸或生理盐水组相比，CCI所致的机械和热痛觉过敏明显减轻；同时，侧脑室注射ERK5反义寡核苷酸抑制了CCI小鼠脊髓p-CREB蛋白的表达。结论脊髓上水平ERK5神经元参与调控小鼠CCI致神经病理性痛，这种作用是通过调节脊髓CREB依赖的基因表达参与的。

山奈酚对阿尔茨海默病模型大鼠的治疗作用及CREB/BDNF信号通路的影响

目的探究山奈酚对阿尔茨海默病模型大鼠的治疗作用及环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)反应元件结合蛋白(Response element binding protein,CREB)/脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信号通路的影响。方法构建阿尔茨海默病模型大鼠,将建模成功的48只大鼠随机分为模型组、山奈酚低(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)剂量组、盐酸多奈哌齐(0.9 mg/kg)组,每组各12只,另选取12只健康大鼠作为对照组,各组大鼠每天给予相应药物干预1次,连续28 d;检测大鼠行为学表现、海马组织病理学变化、海马组织中肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介(Interleukin,IL)-1β、IL-6,CREB,BDNF信使RNA(Messenger RNA,mRNA)和蛋白水平。结果对照组大鼠海马组织神经元结构正常,排列规则;与对照组比较,模型组大鼠海马神经元排列紊乱,核固缩,大量神经元变性坏死,逃避潜伏期、海马组织中TNF-α,IL-1β,IL-6水平显著升高(P<0.05),穿越平台位置次数、平台位置停留时间、海马组织中CREB,BDNF mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,山奈酚低、高剂量组大鼠海马组织病变程度依次减轻,逃避潜伏期、海马组织中TNF-α,IL-1β,IL-6水平依次降低(P<0.05),穿越平台位置次数、平台位置停留时间、海马组织中CREB、BDNF mRNA和蛋白水平依次升高(P<0.05);盐酸多奈哌齐组和山奈酚高剂量组大鼠海马组织病理学变化及各项指标水平比较均无明显差异(P>0.05)。结论山奈酚能改善阿尔茨海默病模型大鼠认知功能,抑制大鼠炎症反应,保护大鼠海马组织,其机制可能与激活CREB/BDNF信号通路有关。