抑制lncRNA TUG1下调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1炎症小体在延缓阿尔茨海默病进展的作用

目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)抑制核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎症小体在缓解阿尔茨海默病进展中的作用。方法选取9~10周龄遗传背景为C57/BL6的野生型小鼠(WT组,10只)或淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠(30只)。APP/PS1转基因小鼠随机分为模型(model)组,模型+敲低lncRNA TUG1组[model+lncRNA TUG1短发夹RNA(shRNA)组]和model+shRNA非靶标(NT)组,每组10只。分别采集12周龄第1天(3月龄)和32周龄第1天(8月龄)小鼠外周血和脑皮质组织,并分离皮质中的原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞,每个时间点每组5只小鼠。Real-time PCR分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的水平,以及原代星形胶质细胞中补体蛋白C1r和C1s mRNA的水平。ELISA法测定其外周血浆中MIF含量。对3月龄和8月龄小鼠脑皮质原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞共培养。CCK-8法测定上述2种细胞的增殖能力。Western blotting分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织中MIF、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1及NLRP3蛋白的表达水平。采用免疫荧光染色法测定8月龄各分组小鼠脑皮质组织中β淀粉样蛋白(Aβ)表达。结果3月龄和8月龄时,与WT组小鼠相比,model组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF相对表达水平显著上调,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF的相对表达水平显著降低,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力降低(P<0.05)。与WT组相比,model组小鼠外周血浆中MIF含量显著升高;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1以及NLRP3的蛋白表达水平显著升高;Aβ免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠外周血浆中MIF含量显著降低;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)和NLRP1的蛋白表达水平显著降低,Aβ免疫荧光强度明显降低(P<0.05),而NLRP3蛋白质的表达水平无明显变化(P>0.05)。与model组相比,model+shRNA NT组小鼠上述所有检测指标差异均无显著性(P>0.05)。结论APP/PS1转基因小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF因子表达上调与脑皮质内NLRP1炎症小体激活成正相关,敲低lncRNA TUG1可缓解阿尔茨海默病的进展。

LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT在糖尿病肾病患者中的表达及与肾功能的相关性研究

目的探究长链非编码RNA锌指E盒结合同源盒蛋白1反义链1(LncRNA ZEB1-AS1)和长链非编码RNA性别决定相关基因簇2重叠转录本(LncRNA SOX2OT)在糖尿病肾病(DN)患者中的表达及与肾功能的相关性。方法选取于2021年11月—2023年12月在武汉大学人民医院肾内科收治的DN患者106例为DN组,并根据24 h尿蛋白定量(24 h Upro)水平分为正常蛋白尿亚组43例(<30 mg)、微量蛋白尿亚组39例(30~<300 mg)、大量蛋白尿亚组24例(≥300 mg),另选取同期医院单纯糖尿病患者106例作对照组,检测患者血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平;Pearson法分析LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT与肾功能指标的相关性;Logistic分析影响DN患者肾功能损伤的因素。结果DN组血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平低于对照组(t=11.471、10.257,P均<0.001)。血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT比较,正常尿蛋白亚组>微量尿蛋白亚组>大量尿蛋白亚组(F=58.720、117.722,P均<0.001),BUN、SCr、UA水平比较,正常尿蛋白亚组<微量尿蛋白亚组<大量尿蛋白亚组,差异均有统计学意义(F=122.493、595.589、53.178,P均<0.001);LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT分别与BUN、SCr、UA呈负相关(r=-0.487、-0.498、-0.521,-0.527、-0.515、-0.534,P均<0.001);Logistic回归分析显示,糖尿病病程长及高BUN、SCr、UA水平是影响DN患者肾功能损伤的危险因素[OR(95%CI)=1.672(1.128~2.479)、2.839(1.534~5.253)、2.754(1.512~5.017)、2.693(1.464~4.954)],高LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT是保护因素[OR(95%CI)=0.875(0.798~0.959)、0.898(0.832~0.969)]。结论血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平与DN患者肾功能有关,可能是评估DN患者肾功能的潜在指标。

家蚕AGO1蛋白结合RNA的分离与鉴定

RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)核心蛋白为Argonaute(AGO)家族蛋白,作为miRNA及RNAi功能途径中的关键蛋白,能够结合miRNA和siRNA,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。因此,利用AGO蛋白抗体通过免疫沉淀分离其结合RNA是目前规模化分离鉴定miRNA及相关小RNA靶基因的重要方法。首先对家蚕AGO1基因进行克隆表达和抗体制备,用自制的兔多克隆抗体免疫沉淀家蚕组织内源BmAGO1蛋白,成功分离BmAGO1蛋白结合的RNA;同时在BmN细胞中采用6×His标签融合表达BmAGO1蛋白,用His单抗免疫沉淀His-BmAGO1蛋白,同样成功分离获得其结合RNA。qRT-PCR检测发现,BmAGO1蛋白结合的RNA中含有家蚕miRNA靶基因BmEm4的mRNA。研究结果为批量鉴定家蚕miRNA靶基因奠定了基础,同时也为深入研究BmAGO1蛋白在家蚕中的功能提供了依据。

BRCA1基因全长mRNA序列分析技术

目的:建立BRCA1基因全长mRNA序列测定方法。方法:根据文献和GenBank(U14680)报道的BRCA1基本序列设计6对特异性引物,建立6个特异性逆转录PCR(RT-PCR)技术,分段且扩增BRCA1全长mRNA,然后采用毛细管电泳进行cDNA测序,方法建立后用于3名健康女性样本。结果:6个特异性RT-PCR反应扩增片段相互覆盖,使序列分析结果包括全长BRCA1mRNA,共5000多bp。3名经PCR技术检测确定携带正常BRCA1基因的样本的mRNA分析结果显示,其BRCA1mRNA序列均与过往报道的正常mRNA序列完全一致。结论:所建立的RT-PCR特异性结合BRCA1基因,能用于其mRNA全长序列分析。

hsa-miR-655靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的实验研究

目的研究靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNAs。方法通过生物信息学预测可能与CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)作用的miRNAs;将人工合成的野生型和突变型CLCF1基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒;将重组荧光素酶报告载体和miRNAs表达载体共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证miRNA对CLCF1基因翻译水平的抑制作用。结果生物信息学预测结果显示,CLCF1基因3'UTR与hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515等5个miRNAs存在互补结合位点;双荧光素酶实验结果表明,与对照组比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09%,差异有显著性意义(P=0.001),当使用突变型CLCF1基因3'UTR,荧光活性上调至67.22%,说明hsa-miR-655对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用;与对照组比较,hsa-miR-374c和hsa-miR-515组荧光活性分别下调27.27%(P=0.000)和27.74%(P=0.006),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有一定抑制作用;hsa-miR-300和hsa-miR-381组与对照组相比,荧光活性分别下调6.35%(P=0.213)和9.89%(P=0.127),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达无明显抑制作用。结论 hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的表达。

YB-1基因沉默抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移

目的探讨RNA干扰沉默Y-盒结合蛋白1(YB-1)对前列腺癌细胞株PC-3细胞增殖和侵袭力的影响。方法将YB-1siRNA(pGenesil-1-YB-1-1、pGenesil-1-YB-1-2质粒)用脂质体转染PC-3细胞(转染组),以逆转录-PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Wesretn blotting)分别检测YB-1mRNA和蛋白的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法和Transwell小孔实验检测PC-3细胞的增殖和侵袭力。结果与质粒对照组相比,转染组YB-1mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。重组质粒pGenesil-1-YB-1-1和pGenesil-1-YB-1-2组mRNA的抑制率分别达36.23%和39.42%,YB-1蛋白的抑制率分别达41.56%和55.33%。与正常对照组相比,转染组细胞增殖明显抑制(P<0.05),转染处理的穿膜细胞数明显减少(P<0.05)。结论 RNA干扰沉默YB-1基因表达降低了前列腺癌细胞的增殖和迁移能力。

猪SREBP-1c基因表达谱及其对肌内脂肪细胞脂质沉积的影响

为探究固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)基因对猪脂质沉积的作用机制,采集淮南猪不同育肥时期背最长肌和皮下脂肪组织,利用实时荧光定量(RT-qPCR)技术分析其表达变化趋势;在猪原代肌内脂肪细胞中进行SREBP-1c干扰试验,采用RT-qPCR检测SREBP-1c互作基因及脂质沉积相关基因的表达量,并通过油红O染色检测脂质沉积变化。结果显示,随着育肥进展,SREBP-1c在猪背最长肌和皮下脂肪组织的表达量持续极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)上调,提示SREBP-1c可能对猪背最长肌脂质沉积的调控作用更强。在猪原代肌内脂肪细胞中干扰SREBP-1c,其互作基因PPARγ、C/EBPα及脂质沉积相关基因FAS、FABP4、CIDEC的表达量均极显著(P<0.01)下调。油红O染色结果显示,SREBP-1c表达量降低,肌内脂肪细胞脂质沉积明显减少。以上结果表明,SREBP-1c可通过调控脂质生成相关基因表达,影响肌内脂肪细胞的脂质沉积。

沉默Rbfox1对癫痫模型大鼠海马神经细胞生物学行为的影响及机制研究

目的研究沉默结合RNA的Fox1基因(Rbfox1)对癫痫模型大鼠海马神经细胞生物学行为的影响及其机制。方法2019年8月—10月于西电集团医院神经外科实验室进行实验,选择SD健康雄性大鼠60只,随机选取其中15只作为空白对照组,其余45只建立癫痫模型,按随机数字表法分为模型组、过表达组、沉默组各15只,构建Rbfox1过表达、沉默慢病毒载体,行慢病毒滴定,比较4组大鼠海马神经细胞增殖、凋亡情况及其Akt/mTOR通路蛋白表达量。结果大鼠不同时间点海马神经细胞凋亡率比较,过表达组>模型组>沉默组(F/P=17.500/0.001、7.217/0.001、5.243/0.001),增殖率比较,过表达组<模型组<沉默组(F/P=37.165/0.001、23.632/0.001、3.651/0.001),大鼠海马组织p-p38、p-JNK、p-ERK、Bax、Bim比较,过表达组>模型组>沉默组,Bcl-2比较,过表达组<模型组<沉默组(F/P=53.319/0.001、19.523/0.001、9.580/0.001、3.550/0.001、8.107/0.001、4.770/0.001)。结论沉默Rbfox1基因可抑制海马神经细胞凋亡,促进海马神经细胞增殖,其作用机制可能与调控MAPK通路相关。

乳腺癌组织LncRNA PVT1 ABCG2 mRNA表达与病理特征间关系及KM曲线分析

目的:探讨乳腺癌组织长链非编码RNA浆细胞瘤异位变异基因1(LncRNA PVT1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G2(ABCG2)mRNA表达与病理特征间关系及KM曲线分析。方法:选取2017年1月至2018年12月我院接受手术治疗的80例乳腺癌患者的病例资料;术中留取乳腺癌组织和癌旁组织(距病灶2 cm),比较癌组织及癌旁组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA表达,分析癌组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA表达与病理特征的相关性,COX回归分析乳腺癌患者术后复发的影响因素,比较不同癌组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA表达患者无病生存期。结果:癌组织LncRNA PVT1(0.076±0.011)、ABCG2 mRNA(3.27±0.45)表达高于癌旁组织(0.003±0.001)、(0.82±0.26)(t=59.114、42.165,P<0.05);癌组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移有关(P<0.05);复发者癌组织LncRNA PVT1(0.084±0.010)、ABCG2 mRNA(3.75±0.59)表达高于未复发者(0.074±0.009)、(3.13±0.47)(t=4.048、4.644,P<0.05);COX回归分析显示,癌组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA高表达均为术后复发独立危险因素(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析显示,癌组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA高表达者术后3年无病生存率低于低表达者(P<0.05)。结论:乳腺癌患者癌组织LncRNA PVT1、ABCG2 mRNA异常高表达,且与病理特征及无病生存期相关,有望成为新的治疗靶点。

缺氧诱导因子-1在缺氧诱导一氧化氮合成酶基因表达中的作用

目的 研究缺氧诱导因子-1(HIF-1)在一氧化氮合成酶基因缺氧诱导反应中的作用。方法 体外合成具有HIF-1特异结合位点的DNA片段(红细胞生成素3'-增强子片段),借助脂质体,转入培养的鼠主动脉内皮细胞和肺微血管细胞,用半定量RT-PCR方法测定诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA。结果 (1)大鼠主动脉内皮细胞、肺微血管内皮细胞在常氧下培养,有iNOS基因表达;(2)缺氧能诱导这两种细胞iNOS基因表达增加;(3)野生型EPO3'-增强子片段能阻断缺氧对内皮细胞iNOS基因表达的诱导作用,而突变片段则无此作用。结论 在iNOS基因序列中,可能存在EPO3'-端增强子片段,其参与内皮细胞的缺氧反应。

用酵母单杂交系统筛选人IL-2Rα基因NIRS元件结合蛋白的cDNA

目的筛选与白细胞介素2受体(IL2R)α基因NIRS元件相互作用的结合蛋白。方法采用酵母单杂交体系从HTLV1转化的人外周血淋巴细胞MATCHMAKERcDNA文库中筛选与NIRS相互作用的蛋白。结果经过筛选并排除假阳性后有9个阳性克隆仍保持His+表型和βgal活性;测序后分析发现它们分别属于4个不同蛋白的cDNA克隆。其中一个是已知的反式作用因子Ku抗原,另一个是RNA聚合酶Ⅰ的转录终止因子。它们的C末端分别含有SAP和SANTDNA结合结构域。结论在Jurkat细胞中存在与NIRS元件相互作用的结合蛋白,相关的研究正在进行中。

siRNA沉默p62基因对人肝癌细胞Hep3B的生物学影响

目的:探讨siRNA沉默人肝癌细胞Hep3B中p62基因对人肝癌细胞的生物学影响。方法:人肝癌细胞Hep3B为靶细胞,siRNA通过Lipofectamine 2000转染Hep3B。首先从3条siRNA序列中筛选出1条沉默p62的最佳序列,然后将细胞分为空白对照组、siRNA组、Ncontro(lNC)组及脂质体(Lip)组。分别用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中p62、XPD、p53以及cyclinD1的mRNA和蛋白质的表达量,并用MTT法检测各组细胞的增殖能力。结果:siRNA组中p62、XPD、p53的mRNA表达较其他3组显著下调(P<0.01),而siRNA组中cyclinD1的mRNA表达较其他3组明显上调(P<0.01)。Westernblot检测结果显示各组细胞中p62、XPD、p53及cyclinD1的蛋白表达变化趋势与其mRNA变化趋势相一致。MTT检测显示siRNA沉默p62后,细胞增殖能力增强。结论:p62基因可能通过影响XPD、p53及cyclinD1从而抑制癌细胞生长,并且可能通过DNA损伤检控点来调控细胞增殖。

长链非编码RNA在急性肺损伤中的作用及分子调控机制研究进展

急性肺损伤(ALI)是临床上常见的危重症之一。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码RNA,在染色质形成、转录和转录后翻译等基因表达水平直接或间接参与ALI的发生发展。lncRNA核富集丰富转录物1、lncRNA HOX转录反义基因间RNA及lncRNA牛磺酸上调1等lncRNA可作为竞争性内源RNA,与miR-26a-5p、miR-17-5p及miR-34b-5p等微小RNA结合,调节Wnt1诱导的信号通路蛋白1、Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1蛋白及自噬相关蛋白等下游相关蛋白的表达,参与ALI的发生发展。LncRNA可能通过调控DNA甲基化、组蛋白修饰,在表观遗传水平参与ALI的发生发展;L通过组装转录激活因子和抑制因子,调节白细胞介素6(IL-6)、IL-17、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3/9等蛋白质的转录,在转录水平参与ALI的发生发展;与多种RNA结合蛋白相互作用,在转录后水平调控ALI的发生发展。

冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因的筛选及验证

目的筛选冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞关键RNA结合蛋白基因,并对其进行验证。方法①冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因筛选选择冠状动脉粥样硬化患者5例(观察组)、健康志愿者5例(对照组),采用转录组测序技术检测外周血单个核细胞RNA转录组,运用R软件“edgeR”包筛选P<0.05、|logFC|>1、错误发现率<0.05的单个核细胞差异表达基因。从RNA结合蛋白数据库中下载人单个核细胞的RNA结合蛋白相关基因资料,与外周血单个核细胞差异表达基因取交集后获得冠状动脉粥样硬化单个核细胞RNA结合蛋白相关差异表达基因。运用TopHat2、ABLas软件筛选冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞差异表达RNA结合蛋白相关基因的可变剪接事件。筛选相对表达量最高的单个核细胞RNA结合蛋白相关差异表达基因为关键RNA结合蛋白基因。②冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因验证另选取冠状动脉粥样硬化患者10例(一组)、健康志愿者10例(二组),抽取外周静脉血后分离外周血单个核细胞,采用qRT-PCR法检测2组RNA结合蛋白关键基因。从GEO数据库(GSE40231、GSE43292、GSE100927、GSE27034)数据集中,检索冠状动脉粥样硬化患者、健康志愿者外周血单个核细胞RNA结合蛋白关键基因表达资料。结果冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞的差异RNA结合蛋白相关基因有:过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α、锌指RNA结合蛋白2、SAM域、SH3域和核定位信号1(SAMSN1)、肝配蛋白A型受体2、RNA结合基序蛋白24、多种剪接形式的RNA结合蛋白2、SH3和多个锚蛋白重复结构域1。与对照组相比,观察组患者单个核细胞RNA结合蛋白相关基因的可变剪接事件多(P<0.05)。关键RNA结合蛋白基因为SAMSN1。与二组相比,一组患者外周血单个核细胞SAMSN1相对表达量升高(P<0.05)。GEO数据库数据结果显示,相比于健康志愿者,冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞单个核细胞SAMSN1相对表达量升高(P<0.05)。结论冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因为SAMSN1基因。相比于健康志愿者,冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞SAMSN1基因表达升高,可变剪接事件增多。SAMSN1基因可能通过调控RNA结合蛋白相关基因的可变剪接事件,参与冠状动脉粥样硬化的发生发展。

光系统ⅡD1蛋白表达调控机制研究进展

强光下植物光系统Ⅱ(PSⅡ)易于失活,D1蛋白是PSⅡ受到伤害的原初部位,导致psbA基因编码的D1蛋白降解,同时在多步PSⅡ修复循环中D1蛋白重新合成。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)psbA基因的表达在mRNA加工过程、翻译起始水平上受到严格调控。光通过激活结合在psbA基因mR-NA5’非翻译区(5’-UTR)上的蛋白复合体(RNA-结合蛋白,RBP)而促进翻译,该蛋白质复合体含有氧化还原激活的调节位点。对PSⅡD1蛋白的转化过程、psbA基因转录及翻译进行分析,综述了光系统Ⅱ蛋白表达调节机制的研究进展。

小干扰RNA沉默Y盒结合蛋白-1基因对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体表达的影响

目的观察Y盒结合蛋白-1（YB-1）小干扰RNA（siRNA）对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体（EGFR）的影响。方法针对YB-1mRNA设计特异性siRNA及ControlsiRNA序列转染至A549细胞株，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测空白组、单纯Lipofectamine2000处理组、ControlsiRNA组及YB-1siRNA组细胞中YB-1和EGFR在mRNA和蛋白水平的表达；通过噻唑蓝（MTT）、侵袭实验观察各组细胞的生物学行为变化。结果RT-PCR和Westernblot结果显示实验组YB-1与EGFR的mRNA和蛋白表达降低（分别为0．3820±0．0094、0．4690±0．0032和0．1820±0．0073、0．4210±0．0049），与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。MTT检测转染72h后YB-1 siRNA组吸光度值为1．34±0．11，同时转染48h后YB-1siRNA组侵袭能力较对照组明显降低（P〈0．05）。结论YB-1siRNA能抑制肺腺癌A549细胞株中EGFR的表达，影响肿瘤增殖和侵袭能力。

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Gab1）基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA （siRNA）序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰（RNAi）转化子,聚合酶链反应（PCR）筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×10^9 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平（0.088 ±0.003）较对照（0.947±0.087）组和空白组（0.999±0.067）显著降低（P＜0.01）.结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.

RNA干扰技术沉默生长因子结合蛋白2相耦联的接头蛋白1基因抑制血管生成

目的 探讨应用RNA干扰（RNAi）技术沉默生长因子结合蛋白2相耦联的接头蛋白1（Gab1）基因,使其在体外抑制血管生成.方法 观察人主动脉血管内皮细胞株（EA.hy926）的生长及形态;构建靶向Gab1的小干扰RNA（siRNA-Gab1）表达慢病毒转染EA.hy926细胞;通过Western blot和反转录-聚合酶连反应（RT-PCR）分别检测Gab1蛋白及Gab1 mRNA的表达水平,采用表面培养法构建体外血管生成三维培养模型,观察转染后EA.hy926细胞体外形成血管样结构的数目和长度.结果 与空白组及阴性对照组比较,siRNA-Gab1干扰组EA.hy926细胞形态变化明显,由长梭形逐渐变成星形或多角形;siRNA-Gab1干扰组Gab1蛋白及Gab1 mRNA（0.291 ±0.004）的表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;siRNA-Gab1干扰组三维培养模型中血管样结构的数量（15.600±2.608）个和长度（2.896 00 ±0.736 97） mm均明显减少;其差异有统计学意义（P＜0.05）.而阴性和空白对照组之间比较,细胞形态均呈梭形,Gab1蛋白及Gab1 mRNA（1.001±0.050、1.063 ±0.040）的表达水平、三维培养模型中血管样结构的数量（35.800±2.775）、（38.200±2.588）个和长度（6.3000±0.912 8）、（6.466±1.2529） mm差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 siRNA-Gab1能够抑制EA.hy926细胞中Gab1的mRNA及其蛋白的表达,从而在体外抑制血管生成.

抑制ISL1的表达对胃癌干细胞特性影响的研究

目的研究针对胰岛素基因增强结合蛋白1(ISL1)的小干扰RNA(siRNA)对人胃癌干细胞特性的影响。方法体外合成ISL1的siRNA,转染人胃癌细胞系BGC823和BGC-S,逆转录酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测ISL1基因和蛋白表达的变化,MTT比色法测定细胞存活率。结果构建的针对ISL1基因的siRNA能够显著抑制靶基因ISL1 mRNA和ISL1蛋白的表达。转染48h后BGC823和BGC-S细胞的存活率明显下降。结论 siRNA能明显抑制胃癌细胞BGC823和BGC-S的ISL1表达,从而对进一步研究胃癌干细胞奠定了基础。

SNHG6通过上调ZEB1表达促进食管鳞状细胞癌TE1细胞的侵袭和转移

目的:探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)核仁小分子RNA宿主基因6(small nuclear RNA host gene 6, SNHG6)促进食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞侵袭和转移的作用及其分子生物学机制。方法:使用实时定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测36例ESCC组织及其癌旁组织(标本收集自河北医科大学第四医院2019年2月至8月外科手术的ESCC患者)中SNHG6表达水平;使用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测ESCC细胞系(TE1、Yes-2、Eca9706和Kyse150)中SNHG6表达水平,选用SNHG6高表达的TE1细胞,通过转染SNHG6-siRNA敲低该细胞中SNHG6表达;通过集落形成实验、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别检测SNHG6敲低前后TE1细胞克隆形成、迁移和侵袭能力的变化;采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SNHG6敲低前后TE1细胞中锌指蛋白E-盒结合同源异形盒-1(zinc finger E-box binding homeobox factor 1, ZEB1)、MMP-2和MMP-9蛋白表达的变化。结果:SNHG6在ESCC组织和细胞系中均呈高表达状态(均P<0.01),且在TE1细胞中高表达最为显著。转染SNHG6-siRNA后TE1细胞中SNHG6表达水平显著降低(P<0.01),si-SNHG6-1和si-SNHG6-2组TE1细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力均显著低于对照组(均P<0.01),两组细胞中MMP-2、MMP-9和ZEB1表达水平均显著低于对照组(均P<0.05)。结论:ESCC组织中呈高表达的SNHG6可促进TE1细胞的恶性生物学行为,其机制可能涉及ZEB1表达的上调。