结构蛋白VP4、VP6和VP7对牛轮状病毒的致病作用

牛轮状病毒是引发犊牛严重腹泻的重要病原体,其结构蛋白VP4、VP6与VP7三者的相互作用对病毒的组装与感染发挥着至关重要的作用。在病毒感染过程中,VP4可以影响VP7的抗原性,而VP7通过反向调节VP4又可以影响病毒体对宿主细胞的特异性吸附作用,此外,三者在结构上的特异性分布,不仅可以构成病毒框架和稳定VP4、VP7的空间结构,而且可以增强它们的免疫原性。所以,对结构蛋白VP4、VP6和VP7在结构上和生物学特性上的认识,对于今后在治疗和预防轮状病毒性疾病具有非常重要的生物学意义。

口蹄疫病毒结构蛋白VP1生物信息学分析

VP1是组成口蹄疫病毒衣壳的重要蛋白,具有该病毒的主要抗原位点,其基因序列分析已被广泛用于分子流行病学调查研究。从GenBank数据库检索并下载我国上传的FMDV VP1基因序列36个,以贵州A型FMDV VP1为参考,对蛋白理化性质、二级结构、同源性等进行分析。结果显示VP1基因编码区长度为636bp,共编码212个氨基酸,含有α-螺旋、β-转角等丰富的二级结构。同源性分析表明我国FMDV VP1基因核苷酸相似性为50.3%~99.2%。

食肉动物细小病毒结构蛋白VP2的研究进展

食肉动物细小病毒主要包括犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）、水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus，MEV）及猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV），属于细小病毒科、细小病毒属。这些病毒具有很高的亲缘关系，基因组核苷酸及蛋白质序列相似性高达98％以上，并且呈全球性流行。细小病毒引起的疾病对我国犬科、猫科及鼬科等动物危害非常严重，并造成较大的经济损失。

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因,将其克隆到表达载体pPROEX-HTa中,获得重组质粒命名为VP3/PA,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。SDS-PAGE检测表明,经重组质粒VP3/PA转化、诱导的受体菌E.coliDH5α能表达结构蛋白VP3基因,约33Ku,表达量达到了菌体总蛋白的33.9%,经Westernblot等检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。

SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1及其C端的表达、纯化和反应原性分析

目的：表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VPl及其C端，进行反应原性分析并制备多克隆抗体。方法：以SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VPl编码区的重组克隆载体为模板，设计特异性引物，扩增VPl基因及其C端编码区，然后将该其分别克隆至原核表达载体pET-30a（＋）中，转化大肠杆菌工程菌株BL21（DE3）plysS，经IPTG诱导，以金属离子螯合层析法对表达的VPl、VP1C端融合蛋白进行纯化，经Westernblot对其反应原性进行分析。用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体，以ELISA方法测定抗体效价。结果：实现了SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VPl及其C端的高效表达，表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS—PAGE显示纯化的目的蛋白分别在相对分子质量35000和19000处有单一目的条带，具有较高的纯度。Western blot结果显示，纯化的VP1及其C端均可与牛SAT2型FMDV阳性血清反应，而与阴性对照血清无交叉反应。结论：用纯化的VPl及VP1C融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1：12800以上，具有较高的特异性。

不同传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP_2表达差异性分析

将在不同时间、地域从传染性法氏囊病 (IBD)发病鸡群中获得的 15个IBDV株分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖 ,经氯仿处理后 ,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒 ,检测表明 ,病毒主要分布于 40 %蔗糖层。对纯化病毒进行SDS_PAGE分析 ,结果显示 ,病毒结构蛋白VP2 在不同毒株表达量有较大差异。本实验为IB DV主要保护性抗原VP2

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。

口蹄疫病毒VP1基因的克隆及结构蛋白VP1的原核表达

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒VP1基因的引物,用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD-P1中扩增得到目的基因VP1(639bp),用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体,转化宿主菌BL21(DE3),经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因正确插入了表达载体,用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,VP1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为41Ku,并能被口蹄疫阳性血清所识别,经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34%。口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达与抗原性分析

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性。将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性。目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应。推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa^158 aa)与C末端(200 aa^213 aa)存在较大差异。

口蹄疫病毒结构蛋白VP1上B细胞表位的筛选鉴定

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。

C型口蹄疫结构蛋白VP3的原核表达及生物活性

利用PCR扩增技术,以本实验室构建的C型口蹄疫pMD-P1重组质粒为模板扩增C型口蹄疫VP3片段,并连接到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建阳性质粒pGEX-VP3并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。使用不同IPTG浓度进行诱导,收集菌液进行SDS-PAGE。使用Model 422 Electro-Eluter切胶回收目的蛋白,并进行Western-Blotting分析。结果得到50 ku左右目的条带,证实融合蛋白VP3大肠杆菌中得到以包涵体形式表达,且使用切胶回收后的蛋白能被C型口蹄疫阳性血清识别,具有良好的反应原性。

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。

口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株结构蛋白VP1 H-2d限制性CTL表位预测

[目的]预测A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位。[方法]使用多种在线表位预测软件,包括Syfpeithi、IEDB、Net MHC-3.2、IMTECH和BIMAS预测A型口蹄疫病毒VP1上可能有的H-2d限制性T细胞表位,然后用Prot Param软件分析预测出的候选表位。[结果]综合比较5个表位预测软件的预测结果,遴选出10个候选表位;再结合Prot Param软件分析结果,最后共预测出5个表位：其中H-2Kd限制性表位有第27-35、118-126位,H-2Ld限制性表位有第43-51位,H-2Dd限制性表位有第45-53、146-154位。[结论]预测出5条口蹄疫病毒结构蛋白VP1 H-2d限制性CTL表位,为进一步鉴定口蹄疫病毒CTL表位提供数据和基础。

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。

鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达

采用湖北省云梦县患鹦鹉幼雏病死亡的虎皮鹦鹉体内分离得到的鹦鹉幼雏病毒 (budgerigarfledglingdiseasevirus,BFDV) ,应用PCR方法获得BFDV主要结构蛋白基因 (VP1) ,克隆到 pMD18 T载体 ,构建重组质粒 pMD18T VP1并进行测序 ,结果显示 ,结构蛋白基因 (VP1)与BFDV欧美分离株的同源性为 96 %～ 99% ,表明VP1是BFDV保守基因 ;将VP1亚克隆到原核表达载体pET32 (+)b ,构建重组质粒 pET32 (+)b VP1,转化菌株BL2 1(DE3) ,诱导表达 ,经SDS PAGE和Western blot分析 ,克隆在his tag下游的结构蛋白基因获得了高效融合表达 ,表达的融合蛋白分子量约为 5 5kD。为建立快速、灵敏的鹦鹉幼雏病毒血清学检测方法以及研制基因工程疫苗提供了科学依据。

人类微小病毒B19结构蛋白VP2的重组表达及单克隆抗体的制备

目的:制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体(mAb)杂交瘤。方法:采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因,经克隆、测序确认后,再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体。以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,制备可分泌特异性B19mAb的杂交瘤细胞。以真核表达载体转染CHO细胞后,筛选单细胞表达克隆,将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应。结果:从患者血清标本中扩增出了1665bp长的DNA,测序结果证实为vp2基因。将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了表达。表达产物经SDS-PAGE后,在Mr约为6000处可见1条明显的表达带。Westernblot的结果表明,该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应。以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、克隆化,获得2株分泌特异性的抗VP2mAb的杂交瘤细胞。以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应。用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清,也与筛选到的mAb呈阳性反应。结论:成功地制备抗VP2的mAb,为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础。

结构蛋白VP3第56位精氨酸对口蹄疫病毒O1Ca特性的影响

口蹄疫病毒O1亚型在不同的生长环境中会抗原变异,尤其是结构蛋白VP3第56位氨基酸的变异具有重要意义。在选择压力下,该位置产生组氨酸(H)或精氨酸(R)突变,可影响病毒在体外的噬菌斑形态和体内致病性。本研究利用反向遗传学技术,构建了仅VP3第56位变异的口蹄疫病毒O1Ca,分别突变为H或R(O1Ca-VP3-56H和O1Ca-VP3-56R),并对其在体外的表型和对自然宿主中的致病性进行研究。这两种病毒在体外表现为相似的生长动力学,但有不同的温度敏感性(ts),并对牛和猪有明显不同的致病性。O1Ca-VP3-56H对热稳定,并能诱导产生口蹄疫临床症状;而O1Ca-VP3-56R为ts表型,且不致病,除非VP3第56位在体内回复突变为组氨酸或半胱氨酸。

犬博卡病毒结构蛋白VP1多克隆抗体的制备及特异性鉴定

为深入研究犬博卡病毒(MVC)结构蛋白VP1及其抗体在MVC感染及致病分子机制中的作用,本研究以先期构建的MVC感染性克隆载体pI-MVC为模板,构建VP1结构蛋白(独特区)原核表达载体pET32a(+)-VP1N,转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后进行蛋白可溶性分析;用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,以纯化的VP1N融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗VP1N多克隆抗体;通过ELISA的方法测定VP1N多克隆抗体效价,并采用Western blot和免疫荧光鉴定VP1N抗体的特异性。结果表明:重组蛋白VP1N可高效可溶性表达,分子量约为34 kDa;VP1N融合蛋白免疫兔后,ELISA法测定VP1N多抗效价达1∶1600 000;Western blot结果显示,VP1N多克隆抗体能够与MVC感染靶细胞后的天然VP1蛋白反应;细胞免疫荧光结果显示,该抗体也可与MVC感染WRD细胞中的天然VP1蛋白反应,且发现VP1大量分布于WRD细胞的胞核中。本研究所制备的VP1N抗体具有很好的反应性和特异性,为进一步深入研究VP1蛋白在博卡病毒致病性及感染机制中的研究提供实验基础。

口蹄疫病毒结构蛋白VP1在谷氨酸棒状杆菌中的表达及优化

【背景】口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一。口蹄疫病毒的结构蛋白VP1包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此VP1是研究亚单位疫苗的方向靶标。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂。【目的】利用C.glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1的外源表达。【方法】根据VP1结构蛋白的基因序列、相应功能和C.glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1。C.glutamicum CGMCC 1.15647菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1蛋白的表达情况。最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的VP1的免疫活性。【结果】SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1蛋白能在C.glutamicum CGMCC 1.15647菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36能提高蛋白产量。在此基础上,通过插入不同的5′UTR序列和VP1蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达。发酵试验表明,VP1摇瓶发酵培养最优条件为30℃、24 h。ELISA试验表明,本研究中的VP1可与阳性血清特异性结合。【结论】本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础。