血清抗结核分支杆菌抗体检测与多种结核病筛查试验方法的比较

[目的]选择一种适用于口岸出入境人群快速筛查结核病患者的方法。[方法] 比较血清抗结核分 支杆菌抗体检测与其它结核病筛查试验方法的特异性。[结果] 血清抗结核分支杆菌抗体检测方法的特异性为 97．15％;X射线检查为98．70％;结核菌素试验为63．80％。血清抗结核分支杆菌抗体检测方法的特异性与其它结 核病筛查试验方法的特异性进行比较,差异不具有显著性(P>0．05)。[结论]血清抗结核的分支杆菌抗体检测 方法是一种简便、快速筛查结核病的辅助方法,应尽快运用于出入境人群传染性肺结核的监测工作当中。

副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的 建立 3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法 ,了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法 10 8例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)和传统梯度药敏试验。结果 耐SM (rpsL)、RFP (rpoB)、INH (KatG)基因突变率分别为 78.5 % ,6 8.2 % ,70 .5 % ,其中 ,高耐SM ,RFP ,INH分离株分别为 86 .5 % ,89.3% ,84 .3% ;低耐分离株分别为 2 8.5 % ,16 .5 % ,7.1%。结论 结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系 ,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株 ,少部分在低耐药株发生基因突变。

两种DNA探针杂交检测结核分支杆菌方法的研究

为改进结核杆菌DNA探针的特异性与实用性,研制了以生物素标记的两种对结核分支杆菌特异的DNA探针:一个5’端标记的20bp的寡核苷酸探针和一个采用PCR方法合成的188bp长链探针。两种探针分别与结核分支杆菌的全染色体DNA,以及基因组上IS6110序列的一段317bp的PCR扩增产物进行斑点杂交,以碱性磷酸酶(AP)催化的染色反应检测,测试了两个探针的敏感性和特异性。系统地比较研究了两种探针杂交检测条件:探针的浓度选择,杂交温度与洗膜温度的选择,以及杂交与洗膜温度对检测的敏感性与特异性的影响。寡核苷酸探针和188bp探针杂交检测纯化结核分支杆菌基因组DNA的敏感性分别为100ng与6ng,杂交检测PCR产物的敏感性分别是400pg与50pg。两探针的最佳杂交浓度均为40～160ng/ml,最佳杂交温度分别是42℃与68℃,最佳洗膜温度分别是60℃与60～68℃之间。两种探针均仅与结核分支杆菌及BCG有杂交信号,而与其它受试分支杆菌及非分支杆菌杂交结果都呈阴性。它们的特异性都很强,但188bp探针的敏感性约是寡核苷酸探针的7～16倍,而且188bp探针检测本底较低。

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌rpoB基因突变检测

本文用PCR-SSCP方法直接检测痰标本中结核分支杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分支杆菌利福平耐药性试验的意义,以期建立一种直接检测分支杆菌耐利福平的快速方法。本文用PCR-SSCP方法分析了30例肺结核病人(单耐利福平或含利福平的多种耐药)和20例非结核性肺部疾病病人痰标本。30份肺结核病人的痰用PCR-SSCP检测痰中结核分支杆菌rpoB基因突变:21份痰PCR扩增阳性,其中13份SSCP图谱与参考株H_(37)RvSSCP图谱有差别,4份无差别;4份SSCP分析无条带出现SSCP分析阳性率为43.3%。而用套式PCR扩增,27份PCR扩增阳性,其中23份SSCP图谱与参考株H_(37)Rv有差别,阳性率为76.6%。20例非结核病人的痰,只有3份肺癌病人的痰rpoB基因258bp扩增阳性,其它均为阴性。PCR-SSCP成可望为直接检测临床标本中结核分支杆菌耐利福平的快速方法。

抗结核分枝杆菌38kD抗原单克隆抗体的制备及荧光抗体检测方法的建立

目的制备抗结核分枝杆菌单克隆抗体,经纯化后标记荧光素,建立直接免疫荧光法用于痰标本的结核分枝杆菌检测。方法常规方法制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,用免疫印迹法确认。单克隆抗体采用饱和硫酸铵粗提和SephadexG-50层析纯化。单抗纯化后采用直接法标记异硫氰酸荧光素,标记后的荧光抗体用于临床痰涂片结核分枝杆菌的检测。结果经筛选获得4株单克隆抗体杂交瘤细胞株。ELISA检测小鼠腹水单克隆抗体效价达到1∶6400—1∶12800。免疫印迹实验表明4株单抗均为抗结核分枝杆菌38kDa蛋白单抗,其中两株产生较强的免疫反应条带。采用异硫氰酸荧光素标记纯化的单抗,建立直接免疫荧光检测法,对41份结核病患者的痰标本进行检测,阳性率为90.24%,与抗酸染色法比较,直接荧光检测法敏感性显著高于抗酸染色法(P<0.05)。结论应用抗结核分枝杆菌38kDa蛋白的单克隆抗体,建立直接免疫荧光检测法,应用于临床痰标本结核分枝杆菌检测,对于辅助诊断结核病具有一定价值。

利用PCR结合膜芯片技术检测结核分支杆菌的实验研究

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)结合膜芯片技术用于检测结核分支杆菌的方法。方法:标记生物素的特异性引物,扩增17株菌标本IS6110插入序列的245bp目的基因,结合膜芯片杂交检测结核分支杆菌基因。结果:15株结核分支杆菌标本中有12株扩增出245bp目的基因,2株大肠杆菌及阴性对照标本PCR扩增结果为阴性。经膜芯片杂交,12株结核分支杆菌标本中有11株显色结果为阳性,其余显色结果为阴性。PCR结合膜芯片检测结核分支杆菌的灵敏度为73.3%,特异度为100%。结论:PCR结合膜芯片技术是一种具有发展潜力的检测结核分支杆菌的方法。

凝集试验检测游泳池肉芽肿患者血清中抗海分支杆菌抗体

目的 探讨用凝集试验协助诊断游泳池肉芽肿的可能性。方法 用直接凝集试验和间接凝集试验检测了 3例游泳池肉芽肿患者血清中的抗海分支杆菌抗体。结果 3例患者血清中均可测出抗海分支杆菌抗体 ,正常人血清中检测不出该抗体 ,加入抗人球蛋白可使检测敏感性提高。结论 游泳池肉芽肿患者血清中有抗海分支杆菌抗体 ,可以用凝集试验检测 ,协助疾病的诊断。

抗结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片的临床应用

目的 验证抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片的临床应用价值。 方法 结核病人和正常对照者的血清经芯片识别仪和ELISA同时检测,分析其敏感性、特异性和总符合率。 结果 结核芯片系统检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和诊断指数分别为69 .91%、84 .85%、90. 80%、55. 56%和154. 76%。而ELISA法检测的敏感性、特异性分别为66 .81%和86 .14%。两者检测的总符合率为81 .04%。检测结果间差异无显著性(χ2=1. 5,P >0. 05)。 结论 芯片系统检测的敏感性和特异性符合临床检验要求,具有简便、快速和单人份操作的优点,可用于临床辅助诊断结核病人。

结核分支杆菌临床分离株的基因检测研究

目的检测结核分支杆菌临床分离株的IS986和embB基因序列 ,了解结核分支杆菌及其药物敏感性的基因检测同Bactec 4 6 0自动检测系统的相关性。方法用Bactec 4 6 0检测系统对获自肺结核患者的 8株临床分离菌和 1株质控菌进行菌种及EMB药物敏感性的鉴定 ,采用PCR和PCR DS技术对菌株进行IS986和embB基因检测和序列分析。结果 8株临床分离菌经Bactec 4 6 0自动检测系统鉴定为结核分支杆菌 ,其中 7株对EMB敏感、1株耐药 ,质控株耐药。各分离菌株及质控株PCR检测出IS986和embB基因序列 ,符合率 10 0 %。 1株临床分离耐药株embB基因的第 30 6位密码子发生突变 ,1株敏感株embB基因的第 2 78位和 2 79位密码子有突变 ,其余 6株敏感菌及质控株未发现序列改变 ,符合率 77 8%。结论PCR扩增是一种快速、敏感、特异性的结核分支杆菌鉴定方法 ,鉴定结果同Bactec 4 6 0TB检测系统一致。结核分支杆菌对EMB耐药性的形成同embB基因突变有关。Bactec 4 6 0TB系统检测药物敏感性可发生漏诊或误诊 ,可能造成药敏结果与临床治疗效果不一致的情况。

结核分支杆菌耐利福平基因rpoB变异机理及其检测的研究

目的研究耐利福平株结核分支杆菌rpoB基因变异及其PCR－SSCP检测方法。方法PCR法扩增rpoB基因．纯化克隆．大量质粒制备．经ABI377系统直接测序。结果17株多耐药结核菌，14株检测出rpoB基因变异。496（Arg），507（Gly→Asp），579（Ala→Gly）和583（Pro→Leu）密码子变异未见报道。全部为点突变，主要是错义突变。在511－533密码子区域变异只占66.7％。地区及耐药谱与rpoB变异无明显规律性。SSCP法检测rpoB的结果与之间测序法一致。结论在511－533之间的23个密码子外的变异比例高．结核菌耐RFP变异与此片断外的基因或其他基因突变有关。SSCP可用于结核菌耐RFP基因的检测。

结核抗体结合 T-SPOT.TB 试验对肺部结核分支杆菌感染患者的诊断效果研究

目的探讨结核分支杆菌抗体(TB-Ab)结合结核分支杆菌T细胞斑点(T-SPOT.TB)试验对肺部结核分支杆菌感染患者的诊断效果。方法选择在我院接受治疗的患者166例,其中经过临床诊断确诊为肺部结核分支杆菌感染的患者95例作为研究组,选择同时期在我院进行诊治的非肺部结核分支杆菌感染的患者71例作为参照组。对两组患者分别进行结核分支杆菌抗体单独检测、结核分支杆菌T细胞斑点单独检测及以上两种方式的联合检测,观察两组患者在不同检测方式下的肺部结核分支杆菌感染阳性率及敏感度和特异度。结果研究组T-SPOT.TB检测联合TB-Ab检测的阳性率明显高于二者单独检测(P<0.05);且T-SPOT.TB单独检测的阳性率明显高于TB-Ab(P<0.05)。参照组T-SPOT.TB检测联合TB-Ab检测及T-SPOT.TB单独检测的阳性检出率均高于TB-Ab单独检测(P<0.05);而二者联合检测与T-SPOT.TB单独检测的阳性率无差异(P<0.05);且二者联合检测的特异度明显高于二者单独检测(P<0.05);T-SPOT.TB单独检测的特异度明显高于TB-Ab单独检测(P<0.05)。结论分支杆菌T细胞斑点检测联合结核分支杆菌抗体检测阳性检出率较高;结核分支杆菌抗体单独检测、结核分支杆菌T细胞斑点单独检测及以上两种方式的联合检测都具有较高的敏感度,但分支杆菌T细胞斑点检测联合结核分支杆菌抗体检测的特异度最高,值得临床推广和应用。

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的应用PCR -SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变 ,评价此方法用于结核分支杆菌利福平 (RFP)及异烟肼 (INH)耐药性试验的意义。方法以结核分支杆菌H3 7Rv为对照 ,30例耐RFP(单耐或多耐 )、2 1例耐INH(单耐和多耐 )的结核分支杆菌临床分离株及 10例敏感菌株 ;39例菌阳肺结核患者及 30例非结核性肺部疾病患者痰标本 ,采用PCR SS CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB ,katG ,ahpC基因突变 ,并与药敏试验对照。结果PCR -SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为 79% (31/ 39)、46 % (18/39)及 5 % (2 / 39)。结论PCR -SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分支杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。

结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片的制备

目的:利用克隆表达的7种结核分枝杆菌优势表位抗原,建立可视化抗体检测蛋白芯片,用于结核病辅助诊断。方法:将7种结核分枝杆菌优势表位抗原,即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3点于修饰的基片上,制备可检测7种结核抗体的多靶点蛋白微阵列,建立免疫金银染色检测系统;使用该芯片对48例临床结核病患者血液样品进行检测,并与"金标准"痰涂片(48例)和痰培养(其中的29例)检测结果进行比较,分析其敏感性;对30名献血员血液样品进行检测,分析其特异性。结果:可视化抗体检测蛋白芯片的敏感性分别为98.5%和96.6%,而痰涂片和痰培养检测方法的敏感性分别为35.4%和48.3%;可视化抗体检测蛋白芯片的特异性为93.3%。结论:建立的结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片检测敏感性显著高于痰涂片和痰培养方法,可用于结核病的临床辅助诊断,提高痰涂片和痰培养假阴性的检出率。

结核分支杆菌rpsL基因突变的快速检测

目的 建立快速检测结核分支杆菌rpsL基因突变的方法。方法 用聚合酶链反应(PCR)直接从结核分支杆菌基因组扩增rpsL基因,并直接进行测序鉴定。结果 用引物P1,P2 扩增H3 7RvDNA获得约4 6 0bp片段,经序列测定后,显示与GeneBank中公布的序列一致(同源性99% )。2 8株结核分支杆菌耐SM分离株中,2 0株rpsL基因突变位于4 3位密码子,另8株分离株未出现rpsL基因突变。结论 rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,本研究为进一步研究链霉素作用方式和耐药机制提供了有力手段。

几种方法检测结核分支杆菌的比较

目的 :评价聚合酶链反应 (PCR) ,细菌培养 ,抗酸染色 ,荧光染色对结核病的诊断价值。方法 :PCR检测 43例临床标本中结核分支杆菌 (MTB)DNA ,并与常规细菌学检测作对比。结果 :PCR检测法敏感性为 48.8% ,荧光染色法为 44.2 % ,细菌培养为 32 .6% ,抗酸染色法为 2 5.6%。结果表明 ,PCR法检测结核分支杆菌较抗酸染色法更敏感。结论 :PCR法具有简便快速的特点 ,对结核病有较高的诊断价值。