结核分支杆菌重组MPT64蛋白的血清学诊断

评价结核分支杆菌重组MPT64蛋白为抗原进行结核病血清学诊断的价值。以PPD为对照,通过ELISA方法检测121例结核病人、146例健康体检者、37例卡介苗阳转者血清中的抗结核抗体。结果表明,结核分支杆菌重组MPT64蛋白具有很强的免疫反应性,可以作为结核病抗结核抗体检测的血清学诊断试剂之一。

重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体。结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD。经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上。Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清。结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌。纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .

几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT6 4 (M )、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法 常规皮肤实验法 :灭活H3 7Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5UPPD标准品为阳性对照 ,0 .8μgE、0 .8μgM、0 .8μgA、0 .4 μgA + 0 .4 μgM、0 .4 μgA + 0 .4 μgE、0 .4 μgE + 0 .4 μgM分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm ) ,取二者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5UPPD及 0 .8μgE、0 .8μgM、0 .8μgA、0 .4 μgA + 0 .4 μgM、0 .4 μgA + 0 .4 μgE、0 .4 μgE + 0 .4 μgM ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧 ,每批 6只 ,共 3批。注射后 2 4、4 8、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm) ,取二者的平均值。结果 常规皮肤试验 0 .8μgM、A、M +E及E +A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,而 0 .8μgE抗原及M +A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P <0 .0 5 )。时间效应 :重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径 2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后 ,结果与常规皮肤试验结果一致。结论 从试验结果?

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性

目的 :研究结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白MPT6 4的免疫学特性 .方法 :用原核表达的MPT6 4蛋白免疫BALB/c小鼠 ,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测IFN γ 产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖 ,并对脾脏细菌负荷计数 .结果 :MPT6 4免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显着 .MTT方法检测小鼠的IFN γ 量为 1 0 2 4ng/L ,而生理盐水对照组低于 80ng/L .结论 :MPT6

结核分支杆菌重组38KDa蛋白质抗原免疫学特性的研究

目的研究重组结核分支杆菌蛋白38KDa(rTPA38)的免疫学特性,以寻找特异性的诊断制剂。方法皮肤试验轮圈法:分别以HRV全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏豚鼠备用;以5IU国际37标准品PPD为阳性对照,0.2μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射48h观察红肿、硬结反应的纵横径。以rTPA为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中的特异性抗结核抗体。结果rTPA与PPD均可诱发豚3838鼠迟发型超敏反应(DTH),所产生的DTH反应与PPD相似,而对堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。238例肺结核病组、rTPA和PPD检测的灵敏度分别为65.1%、72.7%。健康献血员组、非结核38呼吸疾病组和卡介苗接种阳转者血清同时用rTPA和PPD检测,rTPA的特异性分别为95.6%、95.9%、383888.5%;PPD的特异性分别为91.8%、85.4%、68.7%。统计结果表明rTPA蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组,其38阳性率差异有显著性(P<0.05)。两者检测卡介苗接种阳转组的阳性率和血清抗体滴度差异有显著性(P<0.05)。结论rTPA38诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似。rTPA蛋白抗原有较高的特异性和灵敏度,是ELISA法的38可靠抗原,可替代PPD成为一种新的特异性诊断制剂。

结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达载体的构建与鉴定

目的在分枝杆菌系统中表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64。方法用PCR法扩增mpt64基因,构建表达载体穿梭质粒pDE22-mpt64。在母牛分枝杆菌中表达MPT64蛋白,间接免疫荧光和Western-blot鉴定、离子亲和层析法纯化目的蛋白。结果大肠—分枝杆菌穿梭质粒pDE22-mpt64可以在母牛分枝杆菌中复制并表达26kDa蛋白。蛋白印迹实验证实可与抗His单克隆抗体特异结合。结论成功构建了结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达质粒,为进一步研究该蛋白奠定了的基础。

结核分支杆菌MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力

目的 研究结核分支杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力。方法 分别用生理盐水 (A)、载体质粒 (B)、卡介苗 (C)和MPT64重组质粒 (D)免疫小鼠 ,通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体 ,免疫 8周后以MTB腹腔内攻击小鼠 ,攻击 4或 9周后 ,分别取肺、肝和脾脏观察病理改变、称取重量、作菌落计数及脾淋巴细胞转化试验。结果 D组1 0只小鼠中只有 4只血清中检测出抗MPT64抗体。MTB攻击 4周后 ,D组鼠脾淋巴细胞转化率显著高于其它 3组 ,A、B、D组肺、肝和脾重量明显高于C组 ,A组脾菌落数较其它 3组明显增多 ,其余脏器菌落数各组无明显区别 ,A、B组可见肺部严重病变 ,C组未见明显病变 ,D组存在个体差异。MTB攻击 9周后 ,A、B组鼠脾淋巴细胞转化率较C组显著降低 ,D组显著增高 ,各组肺、肝和脾重量无显著差别 ,C组肝菌落数明显低于其它 3组 ,其余脏器各组间无显著差别 ,各组鼠肺表面均可见不同程度的病变。所有鼠肝、脾均未见明显病变。结论 MTBMPT64DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠能诱发特异的体液和细胞免疫应答 ,对小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保护效力 。

重组结核分支杆菌38000蛋白质抗原免疫学特性的研究

目的 :探讨国产结核分支杆菌蛋白 380 0 0 (rTPA38)的免疫学特性 ,用以寻找特异性的诊断试剂和筛选新一代疫苗。方法 :( 1)皮肤实验法。H37RV致敏豚鼠 ,5IU国际标准品PPD为阳性对照 ,0 .2 μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射 ,2 4,48,72h后测量红肿硬结反应横纵径。 ( 2 )ELISA检测 9种羊抗分支杆菌血清并检测结核病人血清中特异性抗结核抗体。结果 :0 .2 μgrTPA38蛋白质抗原在 2 4,48,72h结果基本相似 ,与国家标准品相比均可诱发豚鼠迟发性超敏反应 (DTH) ,其效力与PPD相似。rTPA38只与羊抗牛、BCG、耻垢分支杆菌有交叉反应。用rT PA38和PPD为抗原 ,检测肺结核疾病组灵敏度分别为 6 7.2 % ,72 .5 % ;健康献血员组、非结核呼吸疾病组、卡介苗阳转组 ,rTPA38特异性分别为 96 8% ,96 .7% ,87 5 % ;PPD特异性分别为 93.7% ,85 .7% ,6 8.7%。统计结果表明 ,rT PA38蛋白与PPD检测非结核呼吸疾病组、卡介苗阳转组特异性均有显著意义 (P <0 .0 5 )。结论 :rTPA38具有较高的特异性和敏感性 ,并能诱发豚鼠DTH反应 ,有望成为一种新的特异性诊断试剂。

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗的纯化及免疫效果

目的：研究结核分支杆菌 MPT64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫小鼠的效果。方法：通过 Qiagen 质粒纯化试剂盒纯化质粒 DNA；将 25 只 BALB/c 小鼠随机分为四组，生理盐水组、载体质粒组和重组质粒组于第 0 周、第 3 周、第 6 周经肌肉注射免疫小鼠各 1 次，卡介苗组只在 0 周时于皮内注射卡介苗 1 次；通过 ELISA 方法检测小鼠血清中抗 MPT64 抗体。结果：纯化后的 JW4303 和 JW4303-MPT64 质粒 DNA 经电泳证实无 RNA 污染，OD260/OD280大于 1.8，每 2 000 ml 培养菌可获得 2 mg 左右的质粒 DNA。以三个对照组 15 只小鼠的血清抗 MPT64 抗体 OD值x＋2s为正常界限值，免疫 4 周时重组质粒组 10 只小鼠中只有 4 只血清中抗 MPT64 抗体阳性；免疫 7 周时有 5 只小鼠抗体阳性，抗体水平较前略微增高。结论：结核分支杆菌 MPT64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答，免疫效果存在明显的个体差异。

重组结核分支杆菌38000蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应

目的 研究重组结核分支杆菌 3 80 0 0蛋白诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应的特异性及其作为皮试诊断品的可行性。方法 皮肤试剂轮圈法 :将豚鼠分为 5组、每组 5只 ,分别为H3 7Rv全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏备用。生理盐水为阴性对照 ,5IU国际标准品PPD为阳性对照。将 0 2 μg3 80 0 0蛋白质分别注入每只致敏豚鼠的背部双侧皮肤。于注射后 2 4,48h分别测量红肿或硬结的纵、横径 ,并记录两者平均值。结果 PPD与所有受试分支杆菌致敏的豚鼠均产生较强的DTH反应。重组 3 80 0 0蛋白对结核分支杆菌致敏豚鼠所产生的DTH反应与PPD相似 ,而对堪萨斯和偶发分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。结论 3 80 0 0蛋白诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似 ,而特异性高于PPD 。

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗研究进展

结核分支杆菌引起的结核病是一种人、兽共患的慢性传染病,短程督导化疗是治疗该病的主要措施,卡介苗是预防该病的唯一疫苗,但其免疫效果极不稳定。现介绍结核分支杆菌MPT64DNA疫苗构建及其免疫机制等方面的研究进展。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达、纯化和复性

目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签（His-Tag）纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的 获得重组MPT64蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白 ,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原 ,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET1 5b MPT64测序表达除 83位密码子由CCA突变为CCG外 ,其余密码子均与报道的相同 ,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 2 0～ 30 % ,分子量约 2 6kDa ,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 80 %左右 ,每1 0 0ml培养菌可获得 1 0mg左右的重组蛋白。以 33例正常人血清的OD值 + 2S为正常界限值 ,PDD的特异性和敏感性分别为 94% ( 31 /33)、63.7% ( 2 1 /33)、66.7% ;rMPT64纯化蛋白分别为 94% ( 31 /33)、30 .3( 1 0 /33) ;一步法分别为 88% ( 2 9/33)、66.7% ( 2 2 /2 3)。结论 pET1 5b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值

目的评价免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌的临床应用价值。方法采用免疫层析法检测201株分枝杆菌,其中包括4株结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,MTC)标准株、135株结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株、17株非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacterium,NTM)标准株和45株NTM临床分离株的MPT64蛋白。结果 4株MTC标准菌株和135株MTB临床分离株中,138株MPT64蛋白检测阳性,1株检测为阴性,敏感性为99.3%(138/139),17株NTM标准株和45株NTM临床分离株MPT64蛋白检测均为阴性,特异性为100%(62/62),201株结核和非结核分枝杆菌MPT64蛋白检测的准确度为99.5%(200/201)。结论应用免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌敏感性高,特异性强,方法简便、快速、准确,具有良好的临床应用前景。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^(-7) g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/Ag85B MPT6 4 (pcDNA/AM )转染COS 7细胞 ,用RT PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达 .结果 :Ag85B MPT6 4融合基因经双向DNA序列测定 ,碱基突变率为 0 .11%(2 /170 7) ,突变为无意义突变 ;重组质粒转染COS 7细胞后经检测证实 ,该融合基因能在真核细胞中表达 .结论 :成功地构建了Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 。