细胞因子联合结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733用于肺结核的血清学诊断价值

目的:研究可替代的细胞因子联合结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733用于肺结核的血清学诊断价值。方法:对来自广东医科大学附属龙华中心医院的结核病患者(结核病组,n=25)和无症状接触者(ACs组,n=25)的外周血单个核细胞(PBMCs)用结核分枝杆菌γ干扰素释放试验(IGRAs)和休眠相关抗原(Rv1733)进行6 d体外再刺激后,在培养上清液中进行多重细胞因子分析。结果:经IGRAs抗原特异性再刺激后结核病组白细胞介素-2(IL-2)水平高于ACs组(P=0.032)。结核病组和ACs组PBMCs上清液中γ干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、IL-2、IL-6水平与黄金标准γ干扰素(IFN-γ)呈正相关关系(P<0.05)。结核病组IL-2水平与IFN-γ水平无显著相关关系(r=0.305,P=0.105)。采用调整后的IGRAs标准,IL-6检测到结核病组患者(n=23,92.0%)和ACs组患者(n=22,88.0%)的应答比例最高。Rv1733再刺激可提高ACs组中IFN-γ、IP-10、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-17F浓度,而结核病组和ACs组IL-2、IL-22和IL-5水平差异无统计学意义(P>0.05)。经ROC曲线分析,Rv1733诱导的IFN-γ与IGRAs抗原诱导的IL-2组合是对结核患者和ACs分类的最佳选择(AUC:0.928;95%CI:0.883~0.971)。结论:可替代细胞因子联合结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733可提高对结核分枝杆菌感染的诊断能力。

表达结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白重组耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

利用大肠埃希菌—分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,构建能够表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)。采用聚合酶链反应(PCR)方法,从MTB H37Rv基因组DNA中扩增MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段并克隆入pMD18-T载体。序列测定正确后分别亚克隆入大肠埃希菌—分枝杆菌穿梭表达载体pDE22。将重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿孔导入M.s,42℃热诱导表达目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot分析。利用PCR方法扩增获得MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段,大小分别为435 bp和480 bp。基因测序与Genebank公布的基因序列完全一致。SDS-PAGE分析结果表明重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿导入M.s后能够特异性表达目的蛋白,大小约为35 kDa,与理论值相符。Western-blot鉴定结果表明抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体均能够与目的蛋白发生特异性的反应,大小相一致。成功构建表达MTB休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组M.s,并命名为Rv2031c-Rv2626c-rM.s,为其用于结核新型疫苗的研究奠定了基础。

结核分枝杆菌潜伏抗原Rv2628的生物信息学分析

目的运用生物信息学的方法分析结核分枝杆菌潜伏相关蛋白Rv2628的结构与功能。方法自NCBI网站获取Rv2628蛋白的基本信息;利用Protparam、ProtScale预测Rv2628蛋白的理化性质、亲疏水性;应用Signal 6.0 Server、TMHMM Server V.2.0、NLStradamus、PSORTb预测Rv2628蛋白的信号肽、跨膜区域、核定位信号及亚细胞定位;使用NetNGlyc1.0、NetPhos Server v.3.1预测Rv2628蛋白的糖基化位点及磷酸化位点;利用SOPMA分析Rv2628蛋白的二级结构,使用SWISS-MODEL对其进行三级结构同源建模;使用ABCpred、SYFPEITHI预测Rv2628蛋白的相关抗原表位;利用MEGA构建Rv2628蛋白的分子进化树;使用STRING数据库预测与Rv2628蛋白可能发生互作的蛋白;使用autodock实现Rv2628蛋白与化合物的分子对接。结果Rv2628基因全长363 bp,由120个氨基酸构成,分子式为C575H906N178O168S4,等电点(pI)为9.09;Rv2628蛋白亚细胞定位于细胞质,无跨膜结构、信号肽及糖基化位点,存在12个磷酸化位点,包括6个苏氨酸、5个丝氨酸和1个酪氨酸磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋(41.67%)、无规则卷曲(35.83%)为主;Rv2628蛋白含有10个B细胞、6个Th细胞和6个CTL候选表位,三级结构同源建模的GMQE为0.72;苯基香豆素化合物10可以稳定的与Rv2628蛋白结合并发挥抑制作用;此外,Rv2628蛋白可能与Rv1733c、rip3、hrp1、devR、hspX等蛋白存在相互作用,参与结核分枝杆菌潜伏休眠的过程,诱导Th1免疫反应。结论Rv2628蛋白为亲水性蛋白,存在多个磷酸化位点并能够与多种蛋白相互作用,具有高度免疫原性,包含多个优势B细胞、T细胞抗原表位,可作为结核病诊断的候选蛋白。

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B+Rv3407融合基因自杀性DNA疫苗的构建及鉴定

目的构建表达结核分枝杆菌生长期抗原Ag85B和休眠期蛋白Rv3407的自杀性DNA疫苗融合基因表达载体,并检测其在BHK-21细胞中的表达。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85B基因和Rv3407蛋白基因,再以二者的混合物为模板扩增Ag85B+Rv3407融合基因,构建真核表达载体pSCA1/Ag85B+Rv3407,以ELISA法检测其在BHK-21细胞中的瞬时表达。结果从结核分枝杆菌基因组中扩增得到Ag85B+Rv3407融合基因,片段大小为1 323bp,与预期相符。成功构建重组质粒pSCA1/Ag85B+Rv3407,该重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的蛋白(实验组P/N≥2.1)。结论成功构建结核分枝杆菌自杀性DNA疫苗融合基因表达载体,该重新载体能在真核细胞中表达目的蛋白。