小鼠超声雾化吸入结核分枝杆菌噬菌体D29生物安全性的初步研究

目的探讨小鼠超声雾化吸入结核分枝杆菌噬菌体D29的生物安全性,及噬菌体D29在小鼠肺组织中的活性变化规律,旨在为临床治疗肺结核提供一新途径。方法 8只小鼠分成两组,实验组4只超声雾化吸入分枝杆菌噬菌体D29,对照组4只超声雾化吸入空白培养基,观察不同时间肺的组织学改变,并检测不同时间肺组织冲洗液中噬菌体D29的活性。结果小鼠超声雾化吸入噬菌体D29后1、2、3、24h与对照组比较,肺组织结构正常,无任何炎症性改变,肺组织冲洗液中噬菌体D29活性1h后开始急剧下降,24h后无活性。结论小鼠超声雾化吸入噬菌体D29具有较高的生物安全性,噬菌体D29在小鼠肺内的存活具有高度时间依赖性。

结核分枝杆菌L型检测对比噬菌体D29在结核病诊断和治疗的价值

目的结核分枝杆菌L型(MTB-L)检测对比噬菌体D29在结核病诊断和治疗上的价值。方法用噬菌体D29生物扩增法和改良痰IK抗酸染色涂片法、BACTEC MGIT960培养法、结核分枝杆菌L型培养法,对206例活动性结核病患者和160例非活动性结核病患者的晨痰进行结核分枝杆菌L型检测。结果与噬菌体D29生物扩增法相比较,改良痰IK抗酸染色涂片法和BACTEC MGIT960培养法在MTB-L检测上的灵敏度较低(P<0.0167),噬菌体D29生物扩增法较之MTB-L培养法,特异度差异不大。噬菌体D29对非活动性结核病患者的MTB-L检出率为26.9%;对结核病复治患者的MTB-L检出率为78.8%,显著高于初治患者的检出率51.6%(P<0.05);对耐药结核病患者的MTB-L检出率为83.8%,显著高于药敏患者检出率39.6%(P<0.05)。结论噬菌体D29在结核分枝杆菌L型的检测上具有灵敏度高、特异性高、方便快捷的特点,适合在结核病诊断上推广。噬菌体D29具有开发成为对抗结核病复发和耐药药物的潜力。

分枝杆菌病噬菌体33D基因组学特征及抗结核潜力

目的研究分枝杆菌噬菌体33D的基因组特性并探索其抗结核治疗的潜力。方法通过鸟枪法完成33D全基因组测序;使用DNAStar、TRF、Promoter predictions、tRNAscan-SE、Glimmer、BLAST软件分别对33D基因组进行分析。结果噬菌体33D基因组为线性双链DNA,全长50036bp;含有84个推定基因,17个已知功能的基因。其中噬菌体DNA复制相关基因:gene6、7、8、9和gene 14;裂解酶基因:gene 47和gene 48。结论噬菌体33D为烈性噬菌体,具有抗结核潜力,未发现致病基因,可作为"鸡尾酒疗法"的候选噬菌体。

分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin真核表达载体的构建及杀菌试验

目的构建分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin融合蛋白真核表达载体,通过细胞感染模型研究其在胞内对结核分枝杆菌的杀伤效果。方法构建原核重组质粒pET32a-LysinB并诱导表达,纯化蛋白后制备多克隆抗体;构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin并转染进单核巨噬细胞RAW264.7,经制备的LysinB多克隆抗体进行表达鉴定后,建立细胞感染模型并通过抗酸染色和菌落计数检测LysinB/Holin融合蛋白的杀菌效果。结果成功制备LysinB的多克隆抗体。重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin在真核细胞中有效表达LysinB/Holin融合蛋白且对细胞无明显毒性。LysinB/Holin融合蛋白可有效杀伤胞内的结核分枝杆菌。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin对胞内结核分枝杆菌有较好的杀伤效果,且对细胞无明显毒性,具有治疗结核病的潜能。

分枝杆菌噬菌体D29裂解酶基因的表达与鉴定

目的:在耻垢分枝杆菌中表达预测的噬菌体D29裂解酶基因片段,鉴定其细胞壁裂解活性。方法:在分析分枝杆菌噬菌体D29开放阅读框序列的基础上,用PCR法从噬菌体D29基因组DNA中扩增出与裂解酶同源性较高的序列gene10,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒后,在耻垢分枝杆菌中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE检测,对诱导培养重组菌进行混浊度测定、透射电镜观察以鉴定其裂解活性。结果及结论:成功构建了重组穿梭质粒pUV-gene10并使gene10在耻垢分枝杆菌中获得表达,表达产物能有效降低宿主菌培养液混浊度,降解宿主菌细胞壁,证实gene10表达产物为噬菌体裂解酶,并推测其为非经典分泌蛋白。

分枝杆菌噬菌体D29 holin基因的克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

目的研究分枝杆菌噬菌体D29holin基因编码蛋白的理化特点及生物学特性,分析噬菌体抗结核菌的潜力。方法根据GenBank中登录的分枝杆菌噬菌体D29holin基因序列设计上、下游引物,以分枝杆菌噬菌体D29基因组为模板,PCR扩增holin基因,构建重组质粒pET32a-holin,进行双酶切鉴定、测序鉴定及生物信息学分析。结果 PCR扩增得到序列正确的holin基因产物并成功构建重组质粒pET32a-holin。进化分析显示分枝杆菌噬菌体D29holin基因与已知有尾分枝杆菌噬菌体Chy1、Chy4、Chy5holin基因亲缘关系较近。生物信息学分析显示,该基因编码Holin蛋白为稳定、疏水性蛋白,具有2个跨膜区域和亲水性C-端;二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主,有信号肽,蛋白序列中存在2个丝氨酸磷酸化位点。结论分枝杆菌噬菌体D29 Holin蛋白的两个跨膜区及亲水性C-端构象发生变化,有助于阐明Holin"定时"打孔及启动噬菌体裂解细菌的机制,为研发抗结核Holin多肽药物奠定了基础。

分枝杆菌噬菌体D29气溶胶特性的研究

目的为了研究噬菌体D29气溶胶吸入治疗结核分枝杆菌的可行性，测试了噬菌体D29耐雾化能力、喷雾量、气溶胶粒径等气溶胶特性参数。方法负压实验室气雾柜内发生噬菌体D29气溶胶，TSI3321气溶胶粒径分析仪测试了气溶胶空气动力学直径。Anderson六级空气微生物采样器测试了生物粒子气溶胶中值直径。据雾化前后噬菌体D29的浓度变化及体积变化得到噬菌体D29的雾化时间存活率和雾化量。结果噬菌体D29气溶胶空气动力学直径为0．872μm，生物粒子气溶胶中值直径为2．21μm。噬菌体D29在雾化5、15、30、45、60min后的存活率分别为89．78％、77．19％、48．86％、33．99％、30．12％。气溶胶的雾化量为232μl／min。结论噬菌体D29气溶胶粒径、耐雾化能力及喷雾量等气溶胶参数可以进一步进行动物气溶胶吸入治疗结核分枝杆菌感染方面的研究。

分枝杆菌噬菌体D29气溶胶的喷雾和采样介质的初步研究

目的评价PBS、SM液、营养肉汤3种不同的采样液对分枝杆菌噬菌体D29的收集能力;D29在3种不同喷雾介质(生理盐水、去离子水和PBS)中的耐雾化性能;PBS作为采样液时,收集到的D29浓度随时间变化趋势。方法用全玻璃液体冲击式采样器AGI-30收集D29气溶胶并进行判定。结果与结论噬菌体D29在含有微量Tween80的PBS中耐冲击性能最强,将其用于采样能够准确反映气溶胶的浓度,而去离子水作为喷雾介质时,D29气溶胶具有最大的产出量。在D29气溶胶的动物暴露实验中,选择去离子水为喷雾液用于产生气溶胶,采样液为含微量Tween80的PBS。

分枝杆菌噬菌体D29 LysinB的表达及生物信息学分析

目的扩增分枝杆菌噬菌体D29LysinB基因,对其编码蛋白序列进行生物信息学分析。方法提取分枝杆菌噬菌体D29基因组DNA,PCR扩增LysinB基因并对扩增产物测序;通过在线ProtParam、SOPMA、TMHMM、SWISS-MODEL等程序分析D29LysinB编码蛋白的生物学特征。结果噬菌体D29LysinB基因全长765bp,与预期大小基本一致;基因序列与Genbank上公布的MTB标准株同源性为100%。噬菌体D29LysinB蛋白共254个氨基酸,分子式为C1304H1993N349O358S7,理论等电点为5.78,平均疏水系数为-0.151,为亲水性蛋白。二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占45.67%、10.63%、7.87%和35.83%。噬菌体D29LysinB蛋白是非跨膜或分泌蛋白。预测的B细胞抗原表位为11-28,38-46,50-55,69-75,120-127,132-139,161-171,173-177,210-213,234-237;Th细胞抗原表位为33-47,151-165,100-114,201-215,219-233,223-237,44-58,47-61,158-172,165-179,176-190,235-249;CTL细胞抗原表位为102-110,143-151,52-60,60-68,95-103,217-225,56-64,175-183,240-248,45-53,150-158,199-207。该蛋白与噬菌体Chy5LysinB蛋白进化距离较近。结论生物学信息学方法分析噬菌体D29LysinB蛋白为亲水性蛋白,含有B、Th及CTL细胞其抗原表位,为研究该蛋白在分枝杆菌中的功能奠定了基础。

分枝杆菌噬菌体D29 LysinA的表达及生物信息学分析

目的在耻垢分枝杆菌中克隆表达噬菌体D29LysinA基因,用生物信息学分析LysinA基因所编码蛋白的生物学特性及进化特征。方法增殖、收集噬菌体D29,提取其基因组DNA,PCR扩增LysinA基因后对产物进行测序和比对分析;采用ProtParam软件预测LysinA编码蛋白的结构、特性及进化特征。结果噬菌体D29LysinA基因扩增产物与预期值相符,大小约为1 482bp;测序表明LysinA基因序列与GenBank中已发表的完全一致。LysinA蛋白有493个氨基酸,分子式为C2419H3739N715O725S12,分子质量单位为54.8ku,理论等电点为5.79,在哺乳动物体外的半衰期约为30h;平均疏水系数为-0.443,总体上为亲水性蛋白;二级结构包含α-螺旋(占36.92%)、β-转角(占11.15%)、β-折叠(占17.04%)和无规则卷曲(占34.89%);预测的B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位分别为17、15和21个,并模拟了LysinA蛋白进化树显示噬菌体D29与Chy5亲缘关系较近。结论成功表达了噬菌体D29LysinA蛋白,经生物信息学分析LysinA蛋白具良好免疫原性,为疫苗开发和结核病治疗奠定理论基础。