结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

结核分枝杆菌复合群检验中应用荧光定量PCR方法的临床价值

目的对荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检验结核分枝杆菌复合群的效果做出分析。方法选取2022年3月—2023年5月在长春市传染病医院诊治的疑似结核患者118例作为研究对象,共计156份临床样本,以实验室培养为金标准,对荧光定量PCR法的检验结果进行分析。结果在118例疑似结核患者中,经荧光定量PCR法检测,其阳性检出率为64.10%,与实验室培养检查结果相比,差异无统计学意义(χ^(2)=2.078,P>0.05);经荧光定量PCR法检测,其准确度、特异度、灵敏度分别为97.44%、100.00%、96.15%。结论为结核可疑患者使用荧光定量PCR法进行检测,可获取较高的检测准确度,且灵敏度和特异度均较高,临床应用价值较高。

分泌蛋白在痰液及培养液中鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究

目的评价两种结核菌分泌蛋白试剂分别应用于痰液和培养液中鉴定结核分枝杆菌复合群(MTC)的效果。方法①采用结核分枝杆菌多克隆分泌蛋白试剂对20例健康人呼吸道分泌物以及151例疑为结核病病人痰标本进行检测,同时使用MGIT 960培养仪分离培养,阳性分离菌株进行传统方法鉴定,并使用结核分枝杆菌单克隆分泌蛋白MPT64鉴定。②23株分枝杆菌标准菌株采用MPT64单克隆试剂鉴定。③找出两种试剂的检出限。稀释H37RV标准菌株找出MPT64单克隆试剂的检出限,分析涂片阳性级别与多克隆分泌蛋白试剂结果关系找出该检出限并作比对。结果 MPT64单克隆试剂与多克隆分泌蛋白试剂的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为98.7%、100.0%、88.9%、98.7%和81.0%、85.9%、83.1%、84.0%、83.6%。MPT64单克隆试剂在3 000 CFU/ml的菌液浓度检出。多克隆分泌蛋白试剂在5 000～10 000 CFU/ml的阳性痰中检出。两者的平均检测时间为12 d和1 d。结论应用MPT64单克隆分泌蛋白试剂检测鉴定培养液中MTC是一种准确、快速、简便而又不需要任何仪器设备的实用型方法,值得临床推广应用;而多克隆分泌蛋白试剂可直接应用于痰液中检测鉴定MTC,尽管在灵敏度、特异性、准确度上未尽人意,但其快速性仍不失为一种让人期待的方法。

对硝基苯甲酸鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的机制研究

目的研究对硝基苯甲酸(PNB)鉴别结核分枝杆菌复合群(MTC)与非结核分枝杆菌(NTM)的机制。方法应用高压液相色谱(HPLC)和液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)鉴定5株MTC标准株和33株NTM标准株的PNB代谢产物。结果 33株NTM标准株均可将PNB还原为对氨基苯甲酸(PABA),而5株MTC标准株则不具备该能力。结论 PABA是PNB的代谢产物之一。NTM能将PNB还原为细菌可利用的PABA,因此能够耐受PNB;MTC不具备该能力,因而不能耐受PNB。这可能就是PNB选择性培养基用于鉴别MTC与NTM的机制。

采用gyrB基因扩增快速鉴定结核分枝杆菌复合群的初步研究

目的:初步分析gyrB基因扩增用于结核分枝杆菌复合群(MTC)快速鉴定的可行性。方法:采用特异性引物进行分枝杆菌标准株和临床株的gyrB基因扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳观察聚合酶链反应(PCR)结果。结果:15株各种分枝杆菌标准株中,结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌均扩增出1184bp目的片段,而其余分枝杆菌PCR结果为阴性;94株分枝杆菌临床株中,60株MTB和10株牛分枝杆菌扩增阳性,而其他分枝杆菌(包括6株脓肿分枝杆菌、5株偶发分枝杆菌、4株龟分枝杆菌、3株鸟分枝杆菌、3株胞内分枝杆菌、2株耻垢分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌)均扩增阴性。结论:采用针对MTC的特异性引物进行gyrB基因扩增能快速、准确地鉴别MTC和非结核分枝杆菌。

胶体金法快速检测结核分枝杆菌复合群的效果分析

目的研究分析胶体金法快速检测结核分枝杆菌复合群的效果。方法选择分枝杆菌标准菌株15株和临床菌株435株进行比较研究,通过免疫色谱法试剂盒以及传统生化法鉴定非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合群。结果将传统生化法作为金标准,结果显示胶体金法检测结核分枝杆菌复合群的灵敏度为98.5%,特异度为99.4%,阳性预期值为99.6%,阴性预期值为97.7%。免疫色谱法试剂盒检测结核分枝杆菌复合群的灵敏度为98.5%,特异度为100.0%,阳性预期值为100.0%,阴性预期值为97.7%;和传统的生化方法进行比较发现,两种检测方法均具有较高的一致性。结论胶体金法在临床实验室具有较高的应用价值,可快速鉴定结核分枝杆菌复合群。

结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂相关审评要点

结核病是当前危及人类生命的主要杀手。据世界卫生组织估计,2012年全球约有45万耐多药结核病（MDR-TB）患者,17万人死于MDR-TB,全球1/4的MDR-TB患者在中国[1-3]。鉴于全球耐药结核病的严峻形式,世界卫生组织于2014年推出了《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》（下称《手册》）,旨在指导耐药结核病的预防、诊断和治疗[4-5]。耐药结核病是指由耐药结核分枝杆菌复合群引起的结核病。实验室药敏试验是确诊耐药结核病的唯一方法。

结核分枝杆菌复合群的进展和新成员

结核分枝杆菌复合群（M.tuberculosis-complex，MTC）是分枝杆菌5个复合群之一，也是3大致病性复合分枝杆菌群（鸟胞内和偶然分枝杆菌）之一，简称结核分枝杆菌群或结核杆菌群。上世纪70年代有4个成员（Wayne，1982）即人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，80年代把卡介苗（BCG，减毒牛分枝杆菌）也独立列入，于是MTC有5个老成员。

南疆地区结核分枝杆菌复合群耐药性及同源性分析

目的了解新疆南疆地区的结核分枝杆菌复合群耐药情况及各菌株间的同源性。方法用改良罗氏培养基培养分离菌株及初步鉴定菌种;用比例法对分离菌株进行药物敏感实验;随机抽取50株耐药结核分枝杆菌复合群菌株,用DiversiLab系统进行分型及同源性分析。结果共分离出371株分枝杆菌,结核分枝杆菌314株,牛型结核分枝杆菌55株,非结核分枝杆菌2株。371株中119株(32.1%)有耐药性。根据DiversiLab系统同源性的判断,以相似性95%为分割点,50株耐药结核分枝杆菌复合群分成27个群。其中,初治患者耐药菌同源率为41.2%(7/17),复治患者耐药菌同源率为18.8%(3/16);喀什市的耐药菌同源率为33.3%(5/15),莎车县的耐药菌同源率为41.2%(7/17)。结论南疆地区结核分枝杆菌获得性耐药仍处于较高水平,不同患者群分离的耐药菌均有一定的同源性。

对硝基苯甲酸鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的机制研究

目的 研究对硝基苯甲酸（PNB）鉴别结核分枝杆菌复合群（MTC）与非结核分枝杆菌（NTM）的机制。方法应用高压液相色谱（HPLC）和液相色谱串联质谱法（LC／MS／MS）鉴定5株MTC标准株和33株NTM标准株的PNB代谢产物。结果33株NTM标准株均可将PNB还原为对氨基苯甲酸（PABA），而5株MTC标准株则不具备该能力。结论PABA是PNB的代谢产物之一。NTM能将PNB还原为细菌可利用的PABA，因此能够耐受PNB；MTC不具备该能力，因而不能耐受PNB。这可能就是PNB选择性培养基用于鉴别MTC与NTM的机制。

应用PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种

目的建立快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种的方法。方法将7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物(M tbc1-7)进行聚合酶链反应(PCR)扩增,通过对扩增产物的不同系带型进行分析,对已知标准株和96株临床分离株进行菌种鉴定。结果用3株结核分枝杆菌复合群(MTBC)标准株,9株非分枝杆菌标准株以及27株非结核分枝杆菌的分枝杆菌(MOTT)对7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物进行特异性鉴定,结果证明引物M tbc1能鉴定出分枝杆菌和非分枝杆菌;引物M tbc2能鉴定出MOTT和MTBC;引物M tbc3能鉴定出田鼠分枝杆菌;引物M tbc4能从MTBC中识别出牛分枝杆菌和卡介苗;引物M tbc5能鉴定出非洲分枝杆菌Ⅱ型和结核分枝杆菌;引物M tbc6和引物M tbc4结合能鉴定出卡介苗;引物M tbc7和引物M tbc5联合能鉴定出canettii分枝杆菌。96株临床分离株经7对引物扩增,扩增结果显示MOTT 20株,牛分枝杆菌1株,卡介苗1株,canettii分枝杆菌3株,田鼠分枝杆菌3株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,caprae分枝杆菌1株,结核分枝杆菌或非洲分枝杆菌Ⅱ型64株。结论应用PCR技术鉴定结核分枝杆菌复合群菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值。

××地区肺结核病患者结核分枝杆菌复合群耐药性分析

目的:分析和探讨××地区肺结核病患者结核分枝杆菌复合群耐药性的特点,并结合患者的实际感染情况制定出相应的治疗方案。 方法:选择我市不同的 5 个区县结核病感染部门接收的肺结核病患者作为研究对象共计 1200 例,其中 1200 例中男性为 489 例,女性为 711 例,所有的患者经检测均符合肺结核病特征,采用对硝基苯甲酸(PNB)鉴定培养管进行 MTBC 鉴别试验;采用比例法进行菌株对 9 种抗结核病药物(4 种一线,5 种二线)的体外药物敏感性试验。 结果:在 1200 例检测患者中,MTBC 鉴别试验最终检测人数为,非结核分枝杆菌(NTM)鉴别试验最终检测人数为。 结论:××地区肺结核病患者结核分枝杆菌复合群耐药性分析结果显示,我市 5 个区县结核病患者的分枝杆菌复合群耐药性实际运用效果较好,但是还存在部分患者需要结合其实际情况给予相应的治疗方案,确保后续感染治疗工作能够顺利推进。 此外,还需要不断规范相应的二线抗结核病药物的合理使用,尤其是针对耐药尤其是耐多药和广泛耐药事件的发生,为我市肺结核病患者的感染治疗工作提供相应的基础和保障。

三种方法检测结核分枝杆菌复合群的比较分析

目的初步研究恒温扩增法(Isothermal amplification)、环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、改良罗氏培养基培养法在诊断结核分枝杆菌(Mtuberculosis,Mtb)复合群的临床验证和应用,评估这三种方法检测Mtb复合群的效能。方法选取肇庆市8县区的结核病防治机构2015年1月-2016年8月1496份痰标本,取587例痰培养阳性的培养物,同时进行恒温扩增法、LAMP、改良罗氏培养法检测Mtb复合群。结果罗氏培养法Mtb复合群阳性587例,阳性率39.2%(95%CI:36.7%-41.7%),以此作金标准。恒温扩增法检测Mtb复合群阳性570例,阳性率38.1%(95%CI:35.6%-40.6%),其灵敏度93.1%(95%CI:90.8%-95.1%),特异度97.4%(95%CI:96.2%-98.4%),阳性预期值95.9%(95%CI:94.0%-97.4%),阴性预期值95.6%(95%CI:94.1%-96.9%);LAMP检测Mtb复合群阳性578例,阳性率38.6%(95%CI:36.1%-41.2%),灵敏度93.1%(95%CI:90.8%-95.1%),特异度96.5%(95%CI:95.2%-97.7%),阳性预期值94.6%(95%CI:92.5%-96.3%),阴性预期值95.6%(95%CI:94.1%-96.9%)。结论改良罗氏培养基培养法诊断Mtb复合群具有高度的准确度和特异性,恒温扩增法和LAMP具有等同效能,而LAMP实操比更优,更适合基层结核病实验室应用。

应用PCR-SSCP快速鉴定结核分枝杆菌复合群

通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术分析结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌临床株的１６ＳｒＤＮＡ基因。６０例临床标本中，２０例为阳性，与传统方法比较无差异。其中分型：１８例为结核分枝杆菌，２例为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌双重感染。２０例阴性标本中，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ又检查出５例阳性。２０例对照标本中，３种传统方法与ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法均检测为阴性。全部试验３ｄ报告结果。结核分枝杆菌复合群和卡介苗的图形相同以外，其它分枝杆菌的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ电泳图谱均有差异。所以，应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术快速鉴定结核分枝杆菌是可行的。

基于挥发性代谢产物质谱快速鉴定结核分枝杆菌复合群

目的研究结核分枝杆菌复合群（MTC）相关挥发性代谢产物（VOCs）标记物用于快速鉴定MTC的应用价值。方法以卡介苗（BCG）为MTC代表菌种,用表面解吸常压化学电离质谱（SDAPCI-MS）对BCG、耻垢分枝杆菌和龟形分枝杆菌培养基上层气体行VOCs检测,同时检测临床常见细菌和真菌的VOCs,以确定MTC相关VOCs标记物及释放时间规律。通过碰撞诱导解离（CID）鉴定特异性谱峰的分子量和分子结构式,并用Matlab对其行主成分分析以判断上述相似菌种VOCs组成成分。结果培养至第9天,肉眼可见菌落之前即可检测到特异性烟酸甲酯（m/z 138）存在于MTC培养基上层气体中,与菌液浓度和培养时间呈正相关,经缓慢增长后在25~30 d时含量迅速增加,而后保持稳定。m/z 140和m/z 152在MTC培养基上层气体中含量也显著高于龟形分枝杆菌（t=9.670,P〈0.01;t=95.610,P〈0.01）和耻垢分枝杆菌（t=9.677,P〈0.01;t=94.802,P〈0.01）。质谱检测所得VOCs指纹图可准确鉴别MTC与2种非结核分枝杆菌,并经主成分分析与其他所测实验菌种可明确区分。结论烟酸甲酯为MTC标记物。SDAPCI-MS通过检测微生物的挥发性代谢产物,能快速、准确地鉴定MTC。

结核分枝杆菌复合群耐药性研究进展

结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的成员包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,bTB)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)和山羊分枝杆菌(Mycobacterium caprae)等。其中结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别是人结核病、牛结核病的主要病原菌。至今,结核病仍是威胁人类社会及畜牧业发展的重要人兽共患传染病。世界卫生组织(WHO)估计,2019年全球有1000万(890万~1100万)人感染了结核病,近年来这一数字相对稳定。在所有结核病病例中,8.6%是艾滋病病毒感染者。从地理分布上看,2019年结核病病例大多分布在东南亚(44%)、非洲(25%)和西太平洋(18%)。从全球分布看,印度(26.0%)、印度尼西亚(8.5%)和中国(8.4%)所占比例较高[1]。近年来,由于抗生素过度和不当使用,出现了多种耐药结核菌,包括对一线结核药物异烟肼(Isoniazid,INH)和利福平(Rifampicin,RIF)具有耐药性的耐多药结核菌株(MDR)及在MDR基础上对氟喹诺酮类药物以及二线抗结核注射剂(卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那)中的至少1种耐药的广泛耐药结核菌株(XDR)。抗生素耐药性(AMR)已成为全球结核病防控的难点。据WHO统计,2019年3.3%的新结核病例和17.7%的先前治疗的病例是耐多药结核病。2019年,新发利福平耐药结核病病例约50万例(其中78%为耐多药结核病)。全球结核病负担最大的3个国家分别是印度(27%)、中国(14%)和俄罗斯联邦(8%)。联合国报告预计,如果对抗生素耐药不加控制,到2050年每年可能导致多达1000万人因患结核病而死亡。鉴于此,本文综述了常见抗结核药物及其耐药研究进展,总结了结核耐药监测与检测方法,为结核病耐药性研究提供参考。

结核分枝杆菌复合群检测在AIDS合并结核病诊断中的应用

目的探讨结核分枝杆菌复合群(MTD)检测在获得性免疫缺陷综合征(AIDS)合并结核分枝杆菌感染实验诊断的临床应用。方法采用MTD、结核分枝杆菌培养及抗酸染色3种方法,对127例AIDS合并疑似分枝杆菌感染患者的痰样本进行同步检测,对照组为同期住院非人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的普通疑似结核病患者25例。结果 127例AIDS患者痰样本MTD阳性率为29.1%;结核分枝杆菌培养法阳性率为25.2%;抗酸染色阳性率为18.9%;对照组MTD和结核分枝杆菌培养法的阳性率均为44.0%,抗酸染色阳性率为40.0%。结论 MTD对AIDS合并结核病的诊断有较高的应用价值,在提高阳性率的同时可在1个工作日内提供结核分枝杆菌感染的实验诊断信息。

云浮地区肺结核病患者结核分枝杆菌复合群耐药性分析

目的分析云浮地区肺结核病患者结核分枝杆菌复合群(MTBC)耐药特点,为制定个体化治疗方案提供指导。方法收集云浮市区及4个县区结核病门诊初诊结核病患者痰培养阳性菌株1571株,采用对硝基苯甲酸(PNB)鉴定培养管进行MTBC鉴别试验;采用比例法进行菌株对9种抗结核病药物(4种一线,5种二线)的体外药物敏感性试验。结果1571株菌株中,有1514株(96.4%)被鉴定为MTBC,57株(3.6%)被鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)。有237株(15.7%)MTBC耐药,耐药模式以单耐药为主,耐药率由高到低依次为单耐药(9.60%)、多耐药(3.80%)、耐多药(2.20%)、广泛耐药(0.07%)。体外药物敏感性试验结果显示,菌株对4种一线抗结核病药物的耐药率由高到低依次为链霉素(11.2%)、异烟肼(7.5%)、利福平(3.7%)、乙胺丁醇(3.4%);对5种二线抗结核病药物的耐药率由高到低依次为氧氟沙星(1.8%)、对氨基水杨酸(1.5%)、卷曲霉素(0.5%)和丙硫异烟胺(0.5%)、卡那霉素(0.3%)。耐多药结核病菌株对一线抗结核病药物乙胺丁醇的耐药率最高(67.6%),其次为链霉素(52.9%);对二线抗结核病药物氧氟沙星的耐药率最高(23.5%),对卡那霉素的耐药率为0。菌株对一线抗结核病药物组合异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇、异烟肼+利福平+乙胺丁醇、异烟肼+利福平的耐药率分别为41.2%、26.4%和20.6%,对二线抗结核病药物组合异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星的耐药率为14.7%。发现的唯一1株广泛耐药菌株对9种抗结核病药物均耐药。结论云浮地区肺结核病患者细菌耐药情况遏制较好,但仍需根据体外药物敏感性试验结果选择个体化治疗方案,规范二线抗结核病药物的合理使用,预防耐药尤其是耐多药和广泛耐药情况发生。

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法(R/P分析),探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值。方法根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品。运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较。结果不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%。结论 R/P方法是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策。