结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)对γδ T细胞影响的研究进展

结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)是从结核分枝杆菌(MTB)减毒菌株H37Ra经121℃,20 min,高温高压处理后从菌体释放到上清液中一种多肽类抗原。γδ T细胞是一类广泛分布于非淋巴组织的非常规T细胞,可分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)等细胞因子,在抗MTB感染的免疫应答中发挥重要作用。MTB-HAg可在体外有效刺激γδ T细胞增殖活化,使其更加高效地参与抗结核感染的过程,故MTB-HAg可作为设计新型结核疫苗或药物的潜在靶点。但由于MTB-HAg组成复杂,具体是何种成分刺激γδ T细胞发挥抗MTB感染功能还不清楚。

结核分枝杆菌分泌蛋白早期分泌性抗原6(ESAT-6)的免疫学性质及其在新型疫苗中作用的研究进展

早期分泌性抗原6(ESAT-6)是结核分枝杆菌(MTB)关键的毒力因子,可通过抑制巨噬细胞的吞噬杀菌功能与自噬反应抵抗机体对MTB的清除,从而减弱机体对MTB感染的免疫防御功能。此外,ESAT-6诱导的巨噬细胞的凋亡与固有免疫细胞的大量坏死可促进MTB的扩散、定植,引发MTB的全身感染。ESAT-6还可抑制Th1细胞的保护性免疫反应从而抑制相关促炎细胞因子的分泌,引发机体免疫功能的紊乱,加速MTB感染进程。在这一感染过程中,ESAT-6所具备的高度免疫原性使其可作为优势抗原用于新型结核病(TB)疫苗的研制,具有广阔的发展前景。

CA12-5联合月经血结核分枝杆菌检测对女性生殖系统结核诊断价值研究

目的探讨月经血结核分枝杆菌荧光定量PCR检测(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)联合血清糖类抗原12-5(CA12-5)对女性生殖器结核(female genital tuberculosis,FGT)的诊断价值。方法回顾性分析2018年1月—2021年12月本院收治的160例输卵管性及不明原因不孕、复发性流产者,根据内镜下所见表现及病理检测结果,分析月经血结核分枝杆菌FQ-PCR及外周血清CA12-5含量(<35U/L)的检测效能,同时比较与血清结核分枝杆菌FQ-PCR阳性率及检测时长方面的优势。结果FQ-PCR及CA12-5联合检测对生殖器结核漏诊率为12.82%,低于月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测单独检测的64.10%与CA12-5的35.90%以及血清结核分枝杆菌FQ-PCR的7.18%,同时联合检测时间低于常规检查(培养及胸腔镜下检查)时间(均P<0.05)。结论无创月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测联合外周血清CA12-5在女性生殖器结核诊断方面较单一检测手段诊断效能高,漏诊率低,缩短检测时长,具有一定的临床实用价值。

结核分枝杆菌基因编码RD1-RD3抗原胶体金法检测对辅助诊断菌阴肺结核的价值

目的:探讨结核分枝杆菌基因编码RD1-RD3抗原胶体金免疫学法检测在诊断菌阴肺结核中的临床应用价值。方法:选取2011年6月至2022年6月在滨州市结核病防治院确诊并住院的菌阴肺结核患者87例为试验组,另选取非结核病患者61例为对照组。对照组和试验组患者各留取晨痰一份,进行GeneXpert法和结核分枝杆菌基因编码RD1-RD3抗原胶体金法检测。同时试验组行电子支气管镜肺泡灌洗术,留取肺泡灌洗液分别进行涂片、固体培养法、GeneXpert法和结核分枝杆菌基因编码RD1-RD3抗原胶体金法检测,对各种方法检测的结果进行对比。结果:晨痰GeneXpert法和RD1-RD3胶体金法检测的特异度分别为100%、96.72%,二者差异无统计学意义(χ^(2)=2.033,P=0.154);晨痰GeneXpert法和RD1-RD3胶体金法检测的敏感度分别为13.79%(12/87)和11.49%(10/87),二者差异无统计学意义(χ^(2)=0.208,P=0.648)。试验组87例菌阴肺结核患者肺泡灌洗液涂片、培养、GeneXpert和RD1-RD3胶体金法检测的阳性率分别为10.34%、18.39%、44.83%和42.53%。RD1-RD3胶体金法与涂片和培养的结果相比,差异均有统计学意义(χ^(2)=23.168、11.965,P=0.000);RD1-RD3胶体金法与GeneXpert法的结果相比,差异无统计学意义(χ^(2)=0.093,P=0.760)。结论:GeneXpert法和RD1-RD3抗原胶体金法均具有较高的特异度和敏感度,但在实际应用中GeneXpert法所用仪器和试剂盒昂贵,成本较大,而RD1-RD3抗原胶体金法具有操作简便、快速,成本较低等优点。因而,RD1-RD3抗原胶体金法在辅助诊断菌阴肺结核中具有较高的应用价值,且尤其适合在基层结核病防治机构推广应用。

结核分枝杆菌抗原及其诊断结核病的应用进展

结核病是一种发病率较高的慢性传染病,现代医学研究指出结核分枝杆菌(MTB)感染是引发该疾病的主要原因,发病后对患者身体健康损害较大。目前,虽然能够通过细菌学、免疫学、分子生物学等方式对MTB引起的结核病进行诊断,但受到MTB自身特性的影响,再加上近年来卡介苗(BCG)的普遍接种,导致以上检查方法缺乏较高的灵敏度与特异度,难以对该疾病进行有效诊断。结核病对人们身体健康的危害较大,且具有传染性,发作后若不能及时准确的进行诊断并加以治疗,可能会导致该疾病进一步传播。结核分枝杆菌(MTB)抗原检测是近年来诊断该疾病的新方法,本文研究总结了MTB抗原及其在结核病诊断中的应用情况,希望能够为之后相关方面的研究工作提供一些参考。

结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

目的制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^(-5)。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。

用DNAStar软件预测Rv1410c结核分枝杆菌蛋白抗原表位

目的预测Rv1410c结核分枝杆菌（MTB）的抗原表位。方法利用DNAStar软件包中Editseq软件将Rv1410c MTB氨基酸序列进行编辑保存,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,预测Rv1410c MTB的二级结构、B细胞抗原表位及T细胞抗原表位,然后再用BLAST分析其与人类抗原表位的同源性。结果 Rv1410c具有丰富的二级结构,含有较多潜在的B细胞抗原肽表位,主要位于1~10、67~77、129~137、189~205、222~235、253~267、296~306、330~338、359~367、462~467、494~517氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高;也含有较多潜在的T细胞表位,主要位于16~37、84~102、108~115、137~160、202~207、219~222、245~263、321~325、355~362、387~391、417~445、486~494氨基酸残基或其附近。结论 Rv1410c MTB既含有较多潜在的B细胞抗原表位,也含有较多潜在的T细胞抗原表位。

应用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌体内表达基因

为寻找新型抗结核药物靶标 ,采用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌的体内诱导基因。首先构建了结核分枝杆菌基因组质粒表达文库 ,库容量为 1 0 2× 1 0 5CFU。再用经过结核分枝杆菌和大肠杆菌的裂解产物吸附过的结核病人血清 ,通过原位免疫印迹来筛选基因组表达文库 ,共获得 1 6个阳性克隆。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析 ,发现该 1 6个阳性克隆可能包含 2 2个开放阅读框 (ORF)。按照功能将其分为 7类基因 :脂类代谢 2个、信号途径 5个、PE/PPE蛋白家族 2个、中间产物与能量代谢 6个、细胞壁与细胞处理 1个、假想蛋白 4个和与牛型分枝杆菌定向进化同源的 2个 ,其中部分基因可能与毒力相关 。

结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析

目的:克隆表达结核分枝杆菌Mr16×103和Mr38×103重组蛋白,测定其抗原性和特异性.方法:利用聚合酶链反应自结核分枝杆菌基因组DNA扩增Mr16×103和Mr38×103抗原基因,经测序鉴定后克隆于pGEX4T2表达载体,转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性.结果:携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量分别为42%和18%;Mr16×103和Mr38×103蛋白量分别为:688mg/L和217mg/L.其中Mr16×103蛋白作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为67.0%,特异性为100%,准确性为84.0%;Mr38×103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为79.8%,特异性为99%,准确性为89.7%.结论:以Mr16×103,Mr38×103重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性,可用于结核分枝杆菌诊断方法的建立及临床诊断.

以结核分枝杆菌38kD重组蛋白为抗原的血清学诊断

目的克隆表达结核分枝杆菌38kD抗原基因,并以此蛋白为抗原,进行分枝杆菌的血清学诊断。方法采用PCR自结核分枝杆菌基因组DNA中扩增38kD抗原基因,经测序鉴定正确后,克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,经ELISA检测其抗原的灵敏度与特异性。结果目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的28%,ELISA检测灵敏度为79.8%,特异性为99.0%。结论重组38kD抗原可用于结核分枝杆菌的诊断。

结核分枝杆菌12种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究

目的研究结核分枝杆菌11种重组蛋白和1种脂阿拉伯甘露糖(LAM)的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法将12种抗原包被于酶标板,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测470例血清中抗结核抗体IgG水平,分析不同抗原组合对结核检出的灵敏度与特异度。结果单个抗原检测抗结核抗体的灵敏度介于13.3%(28/210)与40.5%(85/210)之间,特异度介于96.4%(185/192)与99.5%(191/192)之间,4种抗原联合检测的灵敏度和特异度分别达到65.2%(137/210)和92.2%(177/192)。结论多种抗原联合应用可提高结核病血清学诊断的灵敏度和特异度,有助于结核病的临床诊断。

肺结核患者外周血中结核分枝杆菌耐热抗原特异性的TNF-α^＋ γδ T细胞数量和亚群分析

目的探讨结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)刺激下,肺结核患者、潜伏性MTB感染者、健康者外周血γδT细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)产生细胞数量的差异。方法采集15例正常成人外周血,根据人MTB感染T细胞酶联免疫斑点诊断试剂盒检测结果分为健康者(n=9)和潜伏性MTB感染者(n=6),另采集肺结核患者外周血(n=12),3组经密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC),用MTB-HAg刺激20 h。收集细胞,流式细胞术检测TCRαβ+T细胞、TCRγδ+T细胞、CD4+αβT细胞、CD8+αβT细胞、TCR-Vδ2+T细胞亚群中产生TNF-α产生细胞的比例。结果肺结核患者外周血γδT细胞中TNF-α产生细胞比例显著低于潜伏性MTB感染者和健康者;肺结核患者外周血Vδ2T细胞中TNF-α产生细胞比例显著低于潜伏性MTB感染者和健康者;肺结核患者外周血中Vδ2T细胞在TNF-α+γδT细胞中所占比例显著低于潜伏性MTB感染者和健康者。结论肺结核患者外周血MTB-HAg特异性γδT细胞及其Vδ2亚群产生细胞因子TNF-α能力显著低于潜伏性MTB感染者和健康者。

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。

稳定表达结核分枝杆菌38抗原的EL-4细胞株的建立及鉴定

将结核分枝杆菌的38抗原基因片段经PCR方法扩增并插入到pcDNA3真核表达载体中,通过脂质体转染EL-4细胞,经G418筛选,用RT-PCR方法和ELISA方法检测整合和表达情况。结果成功地构建了pcDNA3-38抗原重组质粒,转染细胞中可检测到38抗原的存在,PCR扩增也证实38抗原基因已稳定整合于EL-4细胞的染色体中。本实验为今后在小鼠体内检测结核DNA疫苗激发的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应奠定了基础。

结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CFP10的构建与抗原性初步检测

目的为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,构建了结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10,并且采用双抗原夹心ELISA方法初步分析了该融合抗原的抗原性。方法运用生物学软件分析抗原优势肽段并模拟其串联后的三维结构,以确保串联后仍保持良好的抗原性。通过PCR方法分别扩增38 kD、ESAT-6和CFP10抗原优势肽段基因并将其进行连接,然后将融合基因分别连接入pBVIL1和pGEX-4T-2表达载体,在大肠杆菌菌株DH5α中进行表达。将两种不同载体表达的38 kD-ESAT6-CFP10融合抗原分别作为包被抗原和标记抗原,以双抗原夹心ELISA方法初步评价其抗原性。结果获得了38 kD、ESAT-6和CFP10的抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所获得的抗原具有良好的抗原性。结论该种抗原优势肽段融合抗原有望成为结核病血清学诊断的重要候选抗原,并且双抗原夹心ELISA方法有助于提高检测的特异性和敏感性。

结核分枝杆菌蛋白抗原刺激人γδT细胞的活性单位的计算方法

目的以检测和计算结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)蛋白抗原激活人γδT细胞增殖的活性单位为指标,比较不同提取分离方法制备的Mtb抗原制剂激活人γδT细胞的活性效价。方法培养的Mtb-H37Ra菌株通过高温和超声方法处理,分别获取Mtb耐热抗原(Mtb-HAg)和超声处理抗原(Mtb-SoAg),采用超滤离心管(3 K,10 K,30 K)和快速液相蛋白层析(FPLC)分组和分离,获取不同相对分子质量组分的抗原。采集健康成年人外周血分离获取PBMC,加入不同质量浓度梯度的Mtb蛋白抗原或其分离组分,并加IL-2培养12 d后荧光抗体染色,流式细胞仪检测和分析扩增T细胞中γδT细胞的比例,以扩增γδT细胞最高比例的50%(EC50)所对应的质量浓度计算为1个活性单位。结果用活性单位计算法分析发现,某批次的Mtb-HAg(591μg/ml)刺激γδT细胞扩增的EC50为1.4μg/ml,计算其活性单位为0.71 U/μg;某批次低分子Mtb-SoAg(3 K～10 K)(221μg/ml)的EC50为0.8μg/ml,其活性单位为1.25 U/μg。结论通过比较Mtb蛋白抗原不同批次及其不同组分在不同质量浓度下刺激γδT细胞扩增数量的活性,可以计算获得相应的活性单位,为检测Mtb蛋白抗原制剂刺激γδT细胞增殖活性建立了标准化的计算方法。

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞凋亡的抑制作用

目的探讨结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞的影响及相关机制。方法将MPT64基因在大肠杆菌中表达、纯化,获得的纯化蛋白用于后续实验。将用佛波醇酯(PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、卡介菌纯蛋白衍生物(BCGPPD)诱导组、BCG-PPD+MPT64共同作用组,分别给予相应的处理。孵育16 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用ELISA试剂盒检测培养细胞上清的细胞因子TNF-α及IL-10水平。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,BCG-PPD+MPT64组的细胞凋亡水平低于BCG-PPD组(P<0.05)。细胞因子上清检测结果表明,与对照组相比,BCG-PPD作用组的TNF-α水平升高(P<0.01),而IL-10水平无明显变化;与BCG-PPD组相比,BCG-PPD+MPT64共同孵育组的IL-10水平升高(P<0.01),而TNF-α水平无明显变化。结论 MPT64抗原可能是一种毒力因子,能够抑制BCG-PPD诱导的巨噬细胞凋亡,该作用可能是通过提高IL-10水平来实现的。

结核分枝杆菌抗原分析及免疫交叉反应研究

目的 :筛选和鉴定结核分枝杆菌特异性和保护性抗原 ,研究结核杆菌的免疫反应特点 ,以探索结核病诊断和治疗的新途径。方法 :采用超声破碎和滤膜抽滤的方法分别得到菌体蛋白和滤液蛋白 ,通过Westernblot试验用结核杆菌的单克隆抗体及结核病人血清来检测蛋白样品 ,把发生阳性反应的蛋白在BECKMANLF32 0 0 多肽氨基酸序列测定仪上进行N末端序列分析 ,并用结核杆菌的单抗对自身抗原组蛋白进行了检测。结果 :结核杆菌的 31kD和 30kD蛋白与结核杆菌的单抗及病人血清反应均呈阳性 ,但与正常小鼠血清和健康人血清反应呈阴性。 31kD和 30kD蛋白的N末端序列分别为 :AlaGluValAspTrpLeuValPheAlaVal和PheSerArgProGlyLeuProValGluTyr。结核分枝杆菌的单抗与自身抗原组蛋白能发生免疫交叉反应。结论 :结核杆菌的 31kD和 30kD蛋白是免疫保护性抗原 ,对免疫交叉反应分子基础的进一步研究必将增加对结核免疫机理的了解。

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( +)中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果 重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论 结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性。

结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测

目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性。结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性。结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。