PCR-DNA序列测定法检测脊柱结核分枝杆菌耐药基因的研究

目的研究聚合酶链反应、DNA序列测定在脊柱结核分枝杆菌耐药性临床应用的价值。方法对25例脊柱结核病例脓液、干酪样坏死组织,采用PCR法扩增样本的耐药基因rpoB、rpsL、katG片段;以PCR-DNA序列测定法检测扩增产物,利用DNATools(5.1)软件、NCBI/BLAST公共数据库对耐药基因比较分析。结果 73份耐药基因片段,检测出15份基因突变,其中rpsL基因突变4份,rpoB基因突变5份,katG基因突变6份,平均报告时间6d。结论脊柱结核分枝杆菌耐药基因序列检测具有快速、灵敏和特异性高等特点,与细菌学等方法相结合,能为脊柱结核临床治疗提供有利的帮助。

结核酶联免疫斑点试验、结核分枝杆菌DNA测定和痰涂片检测在肺结核诊断中的比较研究

目的比较结核酶联免疫斑点试验（T—SPOT-TB）、结核分枝杆菌DNA（TB—DNA）测定和痰涂片检测在肺结核诊断中的意义。方法选取2010年5月～2013年1月在本院做结核检测的患者，其中确诊肺结核的患者95例进行T—SPOT-TB、TB—DNA测定和痰涂片检测。结果T—SPOT-TB、痰涂片和TB—DNA测定的敏感性分别为92．22％、24．44％、67．78％，痰涂片的敏感性最低，T—SPOT-TB最高（P〈0．05）。结论T—SPOT-TB较痰涂片、TB—DNA检测对结核病诊断有较高的敏感性。

结核感染T细胞检测和结核分枝杆菌DNA测定在肺结核感染诊断中的联合应用

探讨痰或灌洗液结核分枝杆菌DNA定性测定(TB-DNA)与结核感染T细胞检测(TB-IGRA)联合应用,对肺结核感染诊断的应用价值。方法 以柳州市人民医院就诊的肺结核患者488例(2019.03月~2020.06)为例。另择性别、年龄匹配的同期入院非肺结核病患者154例为对照组。现通过收集该肺结核患者的TB-DNA定性和TB-IGRA检测结果进行分析.探讨痰或灌洗液TB-DNA定性与TB-IGRA检测方法在肺结核感染诊断中的联合应用。结果 结核病组中痰或灌洗液TB-DNA定性灵敏度、血TB-IGRA灵敏度、TB-DNA定性和TB-IGRA联合检出率分别为40.57%、70.08%、75.56%。结论 与TB-DNA定性检測肺结核比较,TB-IGRA检测诊断简单、灵敏度高,但特异度低;痰液对结核杆菌培养时间长,TB-DNA定性检测快速、准确,联合应用TB-IGRA+痰TB-DNA定性检测诊断肺结核效果更佳。

95株耐多药结核分枝杆菌katG基因序列分析

目的分析广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变的分子特征。方法应用PCR-测序法对来自广州地区100株耐多药结核分枝杆菌株katG基因的261～330位密码子长度约210 bp目的片段进行序列测定,并与结核分枝杆菌标准株H37Rv菌株katG基因序列(GenBank:X68081.1,1-4810)进行对比,并应用DNASTAR软件推测氨基酸突变情况。在PCR和基因序列测定中,引物设计相同,上、下游引物分别为5'-GAAACAGCGGCGCTGATCGT-3和5'-GTTGTC-CCATTTCGTCGGGG-3'。结果 100株耐多药结核分枝杆菌菌株中,95株成功扩增出katG基因,95株中有70株呈现katG基因突变(73.68%);基因突变类型均为点突变,突变均发生于315位点,未见插入或缺失型基因突变;氨基酸突变包括3种类型,其中:66株发生AGC(Ser)→ACC(Thr)突变即S315T(94.28%),2株发生AGC(Ser)→ATC(Ile)突变即S315I(2.86%),2株发生AGC(Ser)→AAC(Asn)突变即S315N(2.86%)。结论在所测菌株范围内,广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变率和突变类型具有其特点。

高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究

目的：基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法，并探讨其临床应用价值．方法：设计一对聚合酶链反应(PCR)引物，其中一引物经生物素化修饰，PCR扩增含耐药决定区-297bp长的rpoB基因片段，借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物．设计2个正向测序引物，运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定．通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析，评价所建立方法的检测特异性．

牛分枝杆菌mpb64基因的克隆、鉴定及其表达

以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增mpb64基因,纯化PCR产物并与 pDM18-T载体连接、转化,经酶切及核苷酸序列鉴定为正确后,酶切产物亚克隆到原核表达载体 pET30a(+)的KpnI／EcoRI位点,构建重组表达质粒pET30a+-mpb64,转化到大肠杆菌DE3内,以 IPTG进行诱导,终浓度为1mmol／L,诱导产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明,PCR方法成功扩增 出mpb64基因,核苷酸序列测定验证了其正确性,重组表达质粒表达的pET30a+-mpb64融合蛋白 相对分子量为30.4kDa,与实测相符。牛分枝杆菌pET30a+-mpb64的成功表达为牛结核病的诊断 及新型疫苗的研究奠定了基础。

Ag85B与MPT64DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法 C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1(+)、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果 PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)

结核感染T细胞斑点实验在结核病诊断中的价值

目的探讨结核菌感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)在结核病中的诊断价值,比较研究T-SPOT.TB、结核分枝杆菌DNA测定(TB-DNA)和结核菌素试验(TST)检测在肺结核诊断中的作用。方法收集新疆维吾尔自治区胸科医院痰菌阴性肺结核60例(痰菌阴性组),另纳入痰菌阳性肺结核患者(34例)为痰菌阳性组,以及肺癌、慢性阻塞性肺疾病和支气管肺炎患者(35例)为非结核病组。采用T-SPOT.TB、TB-DNA和TST实验方法对痰菌进行检测。结果 3组T-SPOT.TB阳性率经比较差异有统计学意义(P<0.05)。肺结核组(包括痰菌阴性组、痰菌阳性组)的T-SPOT.TB阳性率均明显高于非结核病组(P<0.05)。痰菌阴性组和痰菌阳性组T-SPOT.TB阳性率差异无统计学意义(χ~2=1.207,P>0.05)。单一指标检测肺结核,T-SPOT.TB的敏感性和特异型分别为88.3%和94.3%,其敏感性高于TST和TB-DNA;其特异性低于TST,高于TB-DNA。结论T-SPOT.TB对痰菌阴性肺结核病的敏感性和特异性都有明显的优势,可以作为痰菌阴性和阳性肺结核病早期诊断的一种辅助检查手段,具有快速、准确的诊断价值。