结核分枝杆菌DnaG引物酶与ssDNA模板相互作用的研究

目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引物酶DnaG(MtuDnaG)在其基因组DNA复制中起着至关重要的作用,因而被认为是抗结核药物研发的新靶点。然而MtuDnaG起始引物合成的机制尚不清楚,这阻碍了MtuDnaG抑制剂的筛选。本研究将鉴定MtuDnaG结合模板的特异性识别位点,探讨MtuDnaG与ssDNA模板之间的相互作用。方法本研究以MtuDnaG的双结构域蛋白MtuP49(包含了锌指结合结构域和RNA聚合酶结构域)为研究对象,利用生物化学和生物物理学方法,研究MtuDnaG与含不同三联体的ssDNA模板之间的相互作用,鉴定MtuDnaG的特异性识别位点。结果5'-GCG/C-3'三联体可能是MtuDnaG结合模板ssDNA的特异性识别位点。此外,在结核分枝杆菌基因组的复制起始点附近也存在可以与MtuP49特异结合的5'-GCG/C-3'位点,其3'端侧翼序列显著影响ssDNA与MtuP49的亲和力。突变实验表明,位于锌指结合结构域中的Arg31对MtuP49结合ssDNA的活性具有重要贡献。基于预测的MtuP49结构,推测在MtuP49结合模板ssDNA过程中,锌指结合结构域会发生分子内重排。结论本研究首次鉴定了MtuDnaG结合模板ssDNA的特异性识别位点,揭示了影响MtuDnaG与模板ssDNA相互作用的主要因素。本文的研究结果不但有助于阐明MtuDnaG起始引物合成的机制,也为靶向DnaG的新型抗结核药物开发提供了新的信息。

与GyrA相互作用的GyrB结构域突变对结核分枝杆菌螺旋酶功能的影响

DNA螺旋酶中的GyrA与GyrB亚基只有互作重组后才有酶活性。为寻找GyrB亚基和GyrA亚基相互作用的关键区域,构建了不同的GyrB亚基突变体,分析GyrB各突变体与GyrA亚基的相互作用对全酶活性的影响。结果显示:GyrB亚基C端是其与GyrA相互作用的主要结构域,结合GyrB的二维结构,提出GyrB中第531~550位氨基酸是影响螺旋酶功能的关键区域,并可能是理想的新药设计靶标。

结核分枝杆菌DNA促旋酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物的相关性研究

目的 分析MDR TB结核分枝杆菌临床分离株的DNA促旋酶（gyr）基因突变特点,初步探究MDR-TB对氟喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变的相关性.方法 采用最低抑菌浓度（MIC）法筛选MDR-TB,对17株临床MDRTB菌株应用DNA直接测序法检测gyr基因的突变情况,分析细菌基因突变与耐药产生的相关性.结果 Mtb 1株标准菌株（H37Rv）未见gyr A亚单位基因（gyrA）和gyr B亚单位基因（gyrB）基因突变,所有17株临床菌株gyrA均存在95位AGC→ACC.12株耐环丙沙星和左氧氟沙星菌株中,10株gyrA产生了错义突变,突变率为83.3％;突变位点位于89位、90位、91位和94位;1株发生了gyrB突变,突变位点位于500位.耐莫西沙星的9株耐药株中,8株gyrA发生突变,占88.9％.结论 gyrA基因突变是Mtb对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA的错义突变主要发生在第89位、90位、91位、94位密码子上.

结核分枝杆菌聚合酶螺旋反应检测方法的建立及效果评价

目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45 min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10~3菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。

荧光定量聚合酶链反应技术检测结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA

目的探讨结核分枝杆菌感染在结节病发病中的作用;方法荧光定量聚合酶链反应技术检测22例结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA;结果22例肺泡灌洗液中9例检出结核分枝杆菌;结论结核分枝杆菌感染可能是结节病病因之一。

荧光定量聚合酶链反应技术检测痰结核分枝杆菌DNA及其临床应用研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术在肺结核诊断中的临床价值。方法对144例活动性肺结核的痰及30例健康对照者的痰进行 FQ-PCR 检测,并与痰涂片检查法、改良罗氏培养法结果进行比较。结果 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率、痰涂片抗酸检查法阳性率、改良罗氏培养法阳性率分别为61.1%(88/144)、51.4%(74/144)、55.6%(80/144),以 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率为最高,FQ-PCR 检测特异性为100%。结论 FQ-PCR 技术检测痰结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,该方法快速、准确,对肺结核的诊断有一定价值。

应用聚合酶链反应检测胸水中结核分枝杆菌DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测１２８例胸水中结核分枝杆菌ＤＮＡ，并将涂片镜检和分离培养作为参比方法。试验结果显示：ＰＣＲ直接检测胸水中结核分枝杆菌的灵敏度为３１个菌体单位、敏感性为４２．３％、特异性为９６．８％，高于涂片镜检和分离培养的检出率（３８．２％和３５．１％）。该法具有敏感性高、特异性强和简便快速等优点，特别适合含微量结核分枝杆菌临床标本的检测，可用于结核性胸膜炎早期和鉴别诊断。

结核分枝杆菌DNA旋转酶B抑制剂的研究进展

DNA旋转酶是抗结核药物的一个新的靶点,其是由两个A亚基和两个B亚基组成的异源四聚体(A2B2)。A亚基含有DNA断裂重聚位点,而B亚基则参与ATP的水解过程,为A亚基提供能量以维持DNA的拓扑状态。因此,针对DNA旋转酶的抑制剂主要分为两类:第一种类型的抑制剂靶向DNA旋转酶A亚基,抑制DNA断裂重聚功能,其中代表药物为氟喹诺酮类药物。第二种类型的抑制剂靶向DNA旋转酶B亚基的ATP结构域并阻断ATP水解。由于第一种类型抑制剂氟喹诺酮类药物已经产生了严重的耐药性。因此,第二种类型的抑制剂成为了当前开发新的强效抗结核药物的研究热点。本文主要对近5年以来结核分枝杆菌DNA旋转酶B抑制剂的最新研究进展进行了综述,同时简要介绍结核分枝杆菌DNA旋转酶B的相关内容。

结核酶联免疫斑点试验、结核分枝杆菌DNA测定和痰涂片检测在肺结核诊断中的比较研究

目的比较结核酶联免疫斑点试验（T—SPOT-TB）、结核分枝杆菌DNA（TB—DNA）测定和痰涂片检测在肺结核诊断中的意义。方法选取2010年5月～2013年1月在本院做结核检测的患者，其中确诊肺结核的患者95例进行T—SPOT-TB、TB—DNA测定和痰涂片检测。结果T—SPOT-TB、痰涂片和TB—DNA测定的敏感性分别为92．22％、24．44％、67．78％，痰涂片的敏感性最低，T—SPOT-TB最高（P〈0．05）。结论T—SPOT-TB较痰涂片、TB—DNA检测对结核病诊断有较高的敏感性。

荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA的流行病学特点

目的了解结核分枝杆菌DNA定量检测的流行病学特点。方法用荧光定量聚合酶链反应技术对438例结核疑似患者进行结核分枝杆菌DNA检测,比较不同标本类型、不同年份、不同性别的感染情况。结果结核分枝杆菌总阳性率为10.27%,晨尿和痰液阳性率较高,分别为20.72%、15.79%;男性和女性阳性率分别为10.39%和8.70%;>31岁年龄组人群结核分枝杆菌感染者所占比例最高,为71.10%;2009、2010年阳性检出率分别为10.81%和10.00%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论结核分枝杆菌DNA在银川地区男女两性间的流行特点相同,2009年和2010年感染率较为稳定。

结核分枝杆菌DNA糖基化酶TagA的表达、纯化及晶体学研究

结核病的病原体结核分枝杆菌是最致命的传染病病原体之一,然而2019年新冠疫情对结核病防治工作造成了沉重打击,因此对结核分枝杆菌进行深入研究有着重要的意义。基因组学的研究表明,结核分枝杆菌来源Ⅰ型3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶TagA(MtbTagA)可识别和切除受损烷基化碱基,以此维持基因组的正常复制、转录和翻译,但其结合底物的类型、催化机制以及结构基础尚不清楚。在大肠杆菌中异源表达MtbTagA,通过镍介质亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析的方法获得高纯度的蛋白。动态光散射(DLS)试验发现MtbTagA蛋白以单体分布于溶液中,可与底物次黄嘌呤(Hx)和3-甲基腺嘌呤(3MA)结合,并改变其聚集状态。进一步结晶筛选优化出片状晶体,通过X光衍射获得分辨率为7Å的衍射数据。该研究为进一步探究DNA糖基化酶蛋白的生化性质和结构性质提供了参考。

结核分枝杆菌DNA疫苗的免疫原性和保护效率的比较研究

对结核分枝杆菌两种DNA单价疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价和比较.将结核分枝杆菌抗原蛋白MPT70(22kDa)和PstS-3(40kDa)克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转化入E.coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,通过诱导表达纯化获得目的蛋白用于DNA疫苗效价鉴定.用真核表达载体pJW4303构建了MPT70,PstS-3(包括信号肽的全基因)两种重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析, 确定含有正确的读码框.用上述DNA疫苗分别肌注免疫小鼠,三免小鼠后21天MPT70 和PstS-3抗体均达到为1∶12800.三免后21天小鼠的脾脏细胞诱导产生较高水平的MPT70和PstS-3特异性的细胞因子γ-干扰素,浓度分别为16872.82pg/ml和11460.98pg/ml.三次免疫后经静脉强毒攻击,两组DNA疫苗免疫鼠的肺脏和脾脏的载菌数均比阴性对照组少,表明这两种疫苗都能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,而且以前者为主.综合各项指标发现,DNA疫苗MPT70要优于PstS-3.

荧光定量聚合酶链反应检测白细胞中结核分枝杆菌DNA

目的 :检测外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA在肺结核诊断中的价值。方法 :应用荧光定量聚合酶链反应技术 ,对95例肺结核患者外周血标本 ,84例肺结核患者痰标本进行了结核分枝杆菌DNA检测。结果 :外周血、痰标本中 ,结核分枝杆菌DNA阳性率为85 %和57 % ;对44例患者外周血、痰标本配对同时检测总阳性率可达91 %。结论 :荧光定量聚合酶链反应检测外周血白细胞中结核杆菌DNA用于肺结核的诊断 ,可提高肺结核诊断的敏感性和准确性 ,明显优于痰标本 ,可作为肺结核诊断较可靠指标。

原位聚合酶链反应检测结核分枝杆菌L型的初步研究

目的 :建立一种不需提取DNA的检测分枝结核杆菌L型的分子生物学方法。方法 :采用原位聚合酶链反应 (原位PCR)技术 ,扩增结核杆菌L型及其感染的人和小鼠血标本中的结核杆菌IS 6 110基因 ,再用免疫组化技术显色。结果 :结核杆菌L型菌株中的DNA被扩增 ,血标本中 ,可见到红细胞和淋巴细胞周围粘附大量结核杆菌DNA阳性颗粒。结论 :红细胞和淋巴细胞具有免疫粘附功能 ;原位PCR快速、简便 ,可用于检测稳定和不稳定分枝杆菌L型。

PCR-ELISA测定结核分枝杆菌DNA临床应用评价

目的 评价聚合酶链反应 酶联免疫吸附试验 (PCR ELISA)测定结核分枝杆菌DNA临床应用价值。方法 用PCR ELISA测定 436例肺结核、172例非结核病人痰标本中的结核分枝杆菌DNA ,并结合临床诊断和痰菌检查对实验结果进行分析。结果 436例活动性肺结核病人本法最终阳性 341例 ,阳性率 78.2 1% ,其中痰菌阳性病人本法阳性率为 97.0 7% ,痰菌阴性病人阳性率为 5 5 .33 % (10 9/ 197) ;而 172例对照患者只有 3例假阳性 ,假阳性率 1.74%。结论 本法测定痰液结核分枝杆菌DNA对肺结核的诊断具有很高的敏感性和特异性 。

PCR-DNA序列测定法检测脊柱结核分枝杆菌耐药基因的研究

目的研究聚合酶链反应、DNA序列测定在脊柱结核分枝杆菌耐药性临床应用的价值。方法对25例脊柱结核病例脓液、干酪样坏死组织,采用PCR法扩增样本的耐药基因rpoB、rpsL、katG片段;以PCR-DNA序列测定法检测扩增产物,利用DNATools(5.1)软件、NCBI/BLAST公共数据库对耐药基因比较分析。结果 73份耐药基因片段,检测出15份基因突变,其中rpsL基因突变4份,rpoB基因突变5份,katG基因突变6份,平均报告时间6d。结论脊柱结核分枝杆菌耐药基因序列检测具有快速、灵敏和特异性高等特点,与细菌学等方法相结合,能为脊柱结核临床治疗提供有利的帮助。

外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA检测结果与肺结核类型关系

目的：探讨外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA检测结果与肺结核类型的关系，以便为临床正确选择检测标本，从而提高检出率提供依据。方法：应用聚合酶链反应技术，同时检测110例Ⅰ-Ⅳ型肺结核患者的外周血白细胞及痰液标本中结核分枝杆菌。结果：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型肺结核患者白细胞中阳性率分别为88.5%、96.4%、25.8%、8.0%,各型间差异显著（P＜0.05）；痰液标本中阳性率分别为53.8%,60.7%,58.1%,58.1%，各型间无显著性差异（P＞0.05）。结论：检测结核分枝杆菌DNA时，Ⅰ型和Ⅱ型肺结核宜选用外周血白细胞标本，而Ⅲ型和Ⅳ型肺结核不宜选用外周血白细胞标本，Ⅰ-Ⅳ型肺结核均可选用痰液标本。

重组表达萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌的构建及其用于最低抑菌浓度测定的研究

目的构建萤火虫荧光素酶（FFLuc）重组表达的结核分枝杆菌菌株，利用其建立抗结核药物最低抑菌浓度（MIC）检测方法，并应用该方法测定目前主要的抗结核药物的MIC。方法（1）以质粒pMV306hsp＋FFLuc为模板，PCR扩增FFLuc基因。构建重组表达质粒pMV361＋FFLuc，电转化至结核分枝杆菌标准株H37Rv中，应用小动物活体成像系统鉴定FFI。tlC表达。比较结核分枝杆菌与重组结核分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。（2）检测不同浓度的异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、莫西沙星（Mfx）、链霉素（Sin）、左氧氟沙星（Lfx）、利奈唑胺（Lzd）作用不同时间的表达荧光量变化，考察在不同药物作用下FFLuc表达的稳定性，建立以FFLuc标记结核分枝杆菌为基础的测定抗结核药物MIC的方法并测定INH、RFP、EMB、Mfx、Sm、Lfx、Lzd等7种药物的MIC。结果（1）pMV361＋FFLuc重组表达载体构建的稳定表达FFLuc的结核分枝杆菌菌株的菌量与荧光表达量（相对荧光强度）呈线性关系[r^2=0．994，lg（y）=0．905×lgCr）＋0．832]。（2）应用新方法检测的7种药物的MIc与微孔培养显色（MABA）法MIC测定结果基本相同。第4天时荧光检测INH、RFP、Mfx、EMB、Sm、Lfx和Lzd的MIC值分别是0．05、0．05、0．09375、4、0．8、0．15、0．15μg／ml；与MABA法检测结果相比，结果在相差1-2倍MIC值的可接受范围内。结论建立了FFLuc重组表达的结核分枝杆菌菌株检测抗结核药物MIC的方法与MABA法相比，所需时间更短，第4天即可检测结果。

PCR检测结核分枝杆菌复合群IS_(986)DNA重复序列

用ＰＣＲ检测ＭＴＢＣ特异的ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列。ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列全长１３５８ｂｐ，特异地存在于ＭＴＢＣ细菌染色体ＤＮＡ中，并且多次重复出现。作者参照文献，在此序列内合成一对引物，扩增出１８８ｂｐ的ＭＴＢＣ特异的ＤＮＡ片段。实验证明具有高度的特异性和敏感性。与其它的分枝杆菌和人血细胞ＤＮＡ无交叉反应。最小检出极限为１０ｆｇＤＮＡ或１０个菌体／ｍｌ。对ＰＣＲ反应体系中有关实验条件如引物浓度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量、循环程序等进行了优化选择。在临床标本细菌ＤＮＡ抽提中首次采用了简便的ＴＥ－Ｔｒｉｔｏｎ煮沸法，节省了成本，使整个检测时间缩短至６～８ｈ。