结核多肽壳聚糖纳米粒的制备及表征

采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒(CS-NPs)载体,并以粒径和多分散系数(PDI)为主要评价指标优化了工艺参数。通过文献检索,筛选出结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTC)标准强菌株H37Rv的保护性抗原蛋白Rv0180c(GLDKNKFDIRVVSPDEARRLY),经异硫氰荧光素(FITC)标记后载入优化的空白CS-NPs中,获得结核多肽壳聚糖纳米粒(Pep-CS-NPs)。所得空白CS-NPs的平均粒径、PDI和ζ电位分别为(148.13±2.24)nm、0.197±0.013和(+18.00±0.89)mV;4℃放置28 d,粒径未见显著增大。Pep-CS-NPs的平均粒径、PDI和ζ电位分别为(186.93±8.80)nm、0.254±0.014和(+12.07±1.68)mV,包封率和载药量为(45.20±2.95)%和(12.92±1.12)%。体外释放结果表明,Pep-CS-NPs缓慢释放多肽,48 h累积释放率为56.6%。本试验表明,离子交联法制备载多肽CS-NPs的工艺简便稳定、条件温和,所得制品粒径大小适宜、分布均匀,且具有明显缓释作用,有望作为治疗结核病的新型疫苗。

神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原诱导的γδT细胞活化及凋亡作用

目的 :研究神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原 (Mtb)诱导的γδT细胞活化及凋亡作用。方法 :用结核杆菌低分子多肽抗原刺激正常人PBMC ,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδT细胞。通过MTT试验观察神经酰胺、鞘磷脂酶以及神经酰胺合成酶抑制剂FumonisinB1对γδT细胞的活化作用 ;FACS检测其对γδT细胞的凋亡作用。结果 :Mtb刺激获得的γδT细胞可达 73 % ,磁珠分选后可高达 98% ;高浓度神经酰胺及鞘磷脂酶能抑制γδT细胞的增殖 ,而出现凋亡 ,FumonisinB1则对γδT细胞的增殖及凋亡无明显影响。结论

结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ＋T细胞的细 …

目的 探讨选择性扩增人γδ＋Ｔ细胞的方法及其细胞毒性。方法 用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原（Ｍｔｂ）刺激正常人ＰＢＭＣ，并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ＋Ｔ细胞，通过ＭＴＴ试验观察γδ＋Ｔ细胞对人红白细胞白血病细胞株Ｋ５６２的细胞观察γδ＋Ｔ细胞对人红白细胞白血病细胞株Ｋ５６２的细胞毒活性。结果 Ｍｔｂ刺激及磁珠分选后的γδ＋Ｔ细胞可达７３％和９８％。

结核特异性CD4^+ α/β TCR四聚体细胞株筛选技术的建立和应用

目的应用不同的MTB多肽以及不同的HLA-DR基因构建的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR复合物的S2恒定细胞株,即人工APC筛选、鉴定结核特异性CD4+α/βTCR四聚体。方法以PE标记的CD4+α/βTCR四聚体、FITC标记的抗HLA-DR抗体(L243),分别与未诱导表达或CuSO4诱导表达后的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR的果蝇S2恒定细胞株,以及与无多肽或结合有结核多肽的、表达HLA-DR的S2细胞株共孵育,流式细胞技术检测分析TCR四聚体与各种细胞株结合率的差异。结果 TCR四聚体6M、6N均与2#细胞株,即C5/HLA-DRB1*0404(1.73%、5.93%)等具有较高的阳性结合率;结核抗原肽孵育后,一些人工APC的四聚体阳性结合率有所提高;所筛选的9个TCR四聚体均与2#细胞株有较高的结合率。结论膜表达结核抗原肽/HLA-DR的S2细胞株,可以应用于结核特异性CD4+α/βTCR四聚体的筛选、鉴定;构建的9个CD4+α/βTCR四聚体均为结核特异性。

ELISA法检测血清TB4抗体对结核病的诊断价值

目的评价结核分支杆菌H37RV多肽(TB4)抗体对结核病的诊断价值。方法采用结核分支杆菌多肽(TB4)为包被抗原,应用ELISA法检测69例临床诊断为肺结核患者、45例支气管炎患者、70例健康体检者血清抗结核抗体水平,计算诊断试验的相关指标。结果TB4抗原以ELISA法检测结核病的敏感性为76.8%、特异性为95.7%、阳性预测值为91.4%、阴性预测值为87.3%、准确率为88.6%。结论以TB4为抗原,采用ELISA法检测血清抗结核抗体,可用于临床结核病的辅助诊断。

结核杆菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T细胞对诱导γδT细胞CD69分子再次表达的影响

目的 观察结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）再刺激Mtb-Ag活化的T细胞（Mtb-AT细胞）诱导γδT细胞CD69分子的再表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用Mtb-Ag刺激PBMC,采用直接免疫荧光染色法通过CD3PE/CD69FITC、γδPE/CD69FITC细胞双染检测γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的表达情况.PBMC经Mtb-Ag刺激活化扩增培养至10 d后再次加入Mtb-Ag,经培养0、6、12、24、48和72 h后收集细胞,再次检测CD69分子的表达情况.结果 培养0、6、12、24、48和72 h后,Mtb-Ag初次刺激γδT细胞后CD69分子的表达分别为0.91％、15.1％、35.2％、75.2％、59.4％和50％.再次刺激培养0、6、12、24、48和72 h后,γδT细胞CD69分子的表达分别为1.7％、72.3％、73.5％、50.3％、45.6％、41.7％.结论Mtb-Ag初次刺激γδT细胞表达CD69分子约在24 h达高峰,随后快速下降;Mtb-Ag再次刺激Mtb-AT细胞诱导γδT细胞CD69分子的再表达,6h时CD69分子达高峰,可维持到12 h.这为寻求γδT细胞迅速活化、CD69分子的迅速表达奠定了方法学基础.

磷脂酰肌醇3激酶特异性抑制剂LY294002对结核杆菌低分子多肽抗原激活γδT细胞的影响

目的观察磷脂酰肌醇3激酶（P13K）特异性抑制剂LY294002对CD3单克隆抗体（CD3mAb）活化的T细胞及结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）激活γδT细胞的影响，探讨P13K在CD3mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的78T细胞TCR途径信号转导中作用。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC），用CD3mAb、佛波醇酯＋离子霉素（PMA＋IM）、Mtb-Ag刺激PBMC，采用流式细胞术检测CD3’T细胞和78T细胞0、6、12、24、48h和72h的CD69分子的表达情况。PBMC经LY294002（0、0．4、2、10~tmol／L）处理后再刺激培养，用EIA试剂盒检测CD3mAb和PMA＋IM刺激组CD3’T细胞白细胞介素（IL）一2的含量；经CD3PE和CD69FITC、v6PE和CD69FITC双染后，检测LY294002对CD3mAb活化T细胞和Mtb．Ag活化的γδT细胞增殖的影响，并计数培养扩增10d的细胞数量。结果用CD3mAb刺激24hCD3’T细胞和γδT细胞CD69的表达均达高峰（均在56％左右），用PMA＋IM刺激6h，均达高峰（均在99％左右），用Mtb-Ag刺激24h，亦均达高峰，但CD3^＋T细胞和γδT细胞CD69的表达分别为（16．0±0．0）％和（75．2±0．7）％，3组同时间点CD3^＋T细胞CD69的表达之间差异均有统计学意义（均P〈0．05），而78T细胞CD69的表达在PMA＋IM刺激组高于CD3mAb刺激组和Mtb-Ag刺激组（均P〈0．05），后两组差异则没有统计学意义（均P〉0．05）。用LY294002终浓度分别为0、0．4、2、10μmol／L处理的样本，CD3mAb刺激组CD3^＋T细胞CD69的表达分别为（52．0±0．5）％、（46．3±0．4）％、（33．2±0．4）％和（19．1±0．0）％；Mtb-Ag刺激组78T细胞CD69的表达分别为（66．2±0．6）％、（58．4＋0．5）％、（38．1±0．3）％和（19．3±0．1）％。0、0．4、2、10μmol／LLY294002处理CD3＋T细胞后，CD3mAb刺激组IL-2的含量分别为（561．1±86．2）、（477．0±75.5）、（280．3±53．9）、（36．0±8．7）ng／L，PMA＋IM刺激组为（1922．2±371．3）、（1928．3±381．7）、（1938．1±262．1）、（1915．4±201．6）ng／L。CD3^＋T细胞的总数由培养前的1．5×10^6分别增殖到（35．6±8．4）×10^6、（31．1±7．3）×10^6、（18．7＋5．0）×10^6和（7．0±2．0）×10^6；γδT细胞的总数由培养前的1．5×10^6分别增殖到（7．0±1．1）×10^6、（4．7＋1．0）×10^6、（1．3＋0．8）×10^6和（0.2±0．1）×10^6。结论Mtb-Ag可特异性的激活78T细胞，其活化信号转导需通过TCR通路，LY294002对CD3mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的γδT细胞具有明显的抑制作用。

MAPK/ERK特异性抑制剂对结核杆菌低分子多肽抗原活化γδΤ细胞的影响

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）特异性抑制剂PD98059对结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）活化γδΤ细胞的影响。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC），分别使用佛波醇酯＋离子霉素（PMA＋IM）、MtbAg刺激PBMC，流式细胞术检测处理0、6、12、24、48和72 h后γδΤ细胞CD69的表达。浓度为0、1、10和100μmol/L的PD98059预处理PBMC后再分别加入MtbAg（MtbAg组）、PMA＋IM（PMA＋IM组）处理24 h，流式细胞术检测活化γδΤ细胞CD69的表达；Mtb-Ag组继续培养10 d后收集细胞计数细胞总数、检测γδΤ细胞比例并计算γδΤ细胞的绝对数量。结果使用PMA＋IM处理6 h，γδΤ细胞CD69表达达高峰；使用Mtb-Ag处理24 h，γδΤ细胞CD69表达达高峰。处理后同一时点两组γδΤ细胞CD69表达比较，差异均具有统计学意义（均P〈0.05）。使用终浓度分别为0、1、10和100μmol/L的PD98059预处理PBMC后再分别加入Mtb-Ag、PMA＋IM处理24 h，流式细胞术检测显示Mtb-Ag组γδΤ细胞CD69表达分别为（79.0±0.8）%、（75.0±0.7）%、（54.0±0.5）%和（17.0±0.2）%，而PMA＋IM组γδΤ细胞CD69表达均在98%以上；MtbAg组继续培养10 d后，细胞总数由培养前的1.5x106分别增殖到（10.3±2.5）x106、（9.5±2.1）x106、（5.8±1.8）x106和（2.1±0.5）x106，γδΤ细胞数分别增殖到（6.2±0.9）x106、（5.0±0.8）x106、（2.1±0.5）x106和（0.4±0.1）x106。结论 Mtb-Ag可以通过MAPK/ERK信号转导通路特异性活化γδΤ细胞。

γδT细胞的扩增及其信号转导分子ζ链相关蛋白-70的免疫印迹检测

目的 检测人外周血γδT细胞的信号转导分子ζ链相关蛋白-70 （ZAP-70）的表达.方法 应用淋巴细胞分离液常规分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）刺激PBMC增殖培养,10d后收集细胞,用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞；采用免疫印迹方法检测γδT细胞内的ZAP-70分子.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4.9％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为69.2％,免疫磁珠阳性分选后达99.3％.免疫印迹显示检测到γδT细胞内相对分子质量为70 000的ZAP-70分子的表达.结论 ZAP-70分子在活化增殖的人外周血γδT细胞内高表达.

Mtb-Ag活化γδT细胞的扩增及对γδT细胞CD69分子表达的影响

目的 用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）激活和扩增γδT细胞,观察γδT细胞表面CD69分子表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用Mtb-Ag刺激PBMC,所得细胞用磁珠阳性分选,通过荧光单抗TCR γδPE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例.用γδPE/CD69FITC细胞双染检测初次刺激和再次刺激γδT细胞CD69分子的表达情况.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为（4.9±1.85）％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为（69.2±6.57）％,免疫磁珠阳性分选后达（99.3±8.92）％.Mtb-Ag初次刺激γδT细胞,CD69分子的表达24 h达高峰,为75.2％;Mtb-Ag再次刺激γδT细胞,CD69分子的表达6h达高峰,为72％.结论 Mtb-Ag能特异地刺激PBMC中的γδT细胞增殖,Mtb-Ag初次和再次刺激均可特异性活化γδT细胞.

流式细胞术检测γδΤ细胞内白细胞介素-2的临床应用价值

目的建立一种人外周血γδΤ细胞细胞内白细胞介素-2(IL-2)的检测方法。方法分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)刺激PBMC,获取较高比例的γδΤ细胞。用佛波醇酯+离子霉素(PMA+IM)刺激PBMC和γδΤ细胞,用蛋白转运抑制剂(Brefeldin A,BFA)阻断细胞内因子的分泌,用皂角素破膜,流式细胞术检测CD3+T细胞内CD69阳性率,以确定最佳的破膜时间,用流式细胞术检测γδΤ细胞内的IL-2的表达。不同组间CD3+T细胞内CD69阳性率及细胞内IL-2的阳性率比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用最小显著性(LSD)法检验.。结果刺激时间不同,CD3+T细胞胞内CD69的阳性率表达不同,皂角素破膜时间为15 min时,CD3+T细胞胞内CD69的阳性率最高,达(87.82±2.28)%,与处理5 min[CD69的阳性率(66.86±1.99)%]和25 min[CD69的阳性率(81.73±2.51)%]比较,差异有统计学意义(F=112.81,P<0.05);不同处理组γδΤ细胞内IL-2表达不同,γδΤ细胞受PMA和IM刺激并有BFA存在时表达最高,达(50.65±6.25)%,与γδΤ细胞组(0.55±0.07)%、γδΤ细胞+PMA+IM组(0.91±0.12)%和PBMC+PMA+IM+BFA组(0.21±0.03)%比较,差异有统计学意义(F=321.07,P<0.05)。结论流式细胞术是一种检测γδΤ细胞内IL-2的较好方法,为γδΤ细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础。

三种方式活化T细胞CD69分子表达观察

目的观察CD3单克隆抗体（CD3mAb）、佛波醇酯＋离子霉素（PMA＋IM）、结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）活化CD3＋T细胞CD69分子的表达情况。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC），用CD3mAb（A组）、PMA＋IM（B组）、Mtb．Ag（C组）刺激PBMC，采用流式细胞术检测。CD3＋T细胞和∞T细胞0、6、12、24、48和72hCD69分子的动态表达情况。结果CD3＋T细胞CD69分子的动态表达情况：CD3mAb刺激组24h达高峰，为56．2％；PMA＋IM刺激组6h达高峰，为99．5％；Mtb-Ag刺激组24h达高峰，为16％。各组比较F=322．528，P〈0．001；两两比较，均P〈0．001。γδT细胞CD69分子的动态表达情况：CD3mAb刺激组24h达高峰，为55．1％；PMA＋IM刺激组6h达高峰，为99．3％；Mtb-Ag刺激组24h达高峰，为75．2％。各组比较F=21．170，P〈0．001；两两比较：CD3mAb与PMA＋IM组比较，PMA＋IM组与Mtb—Ag组比较，均P〈0．001；Mtb-Ag与CD3mAb比较P=0．646。结论PMA＋IM的刺激，CD3＋T细胞和γδT细胞活化达高峰的用时比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要短，CD69的表达率也比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要高，应作为三种方法中CD3＋T细胞活化的首选方法。