探讨ELISA法检测血清结核杆菌抗原对肺结核病的诊断价值

目的探讨检测结核杆菌抗原对肺结核病的诊断价值。方法应用酶联免疫吸附试验检测血清中的结核杆菌分泌蛋白desA抗原。结果 139例活动性肺结核患者血清结核抗原的阳性检出率为84.1%;64例非结核性肺部疾病组结核抗原阳性率7.81%,29例健康对照者均为阴性。特异性为92.19%。结论检测血清中结核杆菌分泌蛋白desA抗原对诊断肺结核病有较高的应用价值。

结核杆菌抗原85A与GM-CSF诱发抗鼠黑色素瘤效应研究

目的:用结核杆菌抗原85A(Ag85A)和细胞因子GM-CSF,作为异种抗原及免疫增强剂,研究其在鼠体内能否有效地诱导抗黑色素瘤免疫应答。方法:用分子生物学法构建重组质粒pRSC-Ag85A/GM-CSF,通过细胞转染获得稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16黑色素瘤细胞。48只C57BL/6小鼠随机均分为B16细胞组、B16-pRSC细胞组、B16-Ag85A细胞组和B16-Ag85A/GM-CSF细胞组,分别将上述不同B16细胞经背部皮下接种小鼠。通过观察其致瘤性的强弱、荷瘤鼠生存时间、鼠血清IFN-γ水平以及CTL、NK细胞杀伤活性,分析Ag85A和GM-CSF在抗肿瘤免疫效应中作用。结果:B16-Ag85A/GM-CSF细胞组小鼠肿瘤生长明显受到抑制,生存时间较对照组平均延长40%,血清IFN-γ分泌较对照组高1倍,CTL、NK细胞杀伤活性与其他各组相比也有较大的提高。结论:接种稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16细胞能降低对小鼠的致瘤性,诱导有效的抗肿瘤效应。

PKCθ在结核杆菌抗原刺激人γδT细胞NFκB活化中的作用

目的初步探讨PKCθ在结核杆菌抗原(MtbAg)刺激γδT细胞转录因子NFκB活化中的作用。方法 MtbAg刺激健康人外周血单个核细胞(PBMC),获得γδT细胞优势扩增细胞群。PKCθ选择性阻断剂rottlerin(粗糠柴毒素)预处理,MtbAg刺激γδT细胞,通过凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)检测γδT细胞NFκB活性,流式细胞术(FCM)检测γδT细胞活化分子CD69的表达。结果 MtbAg刺激30min,γδT细胞NFκB活性逐渐增加,刺激60min时NFκB活性显著增强;rottlerin使Mt-bAg激发的γδT细胞NFκB活性明显减弱。Rottlerin可显著抑制MtbAg诱导的γδT细胞活化分子CD69的表达(P<0.01)。结论 PKCθ参与MtbAg诱导的γδT细胞转录因子NFκB活化。

结核杆菌抗原对人γδT细胞体外增殖影响

目的观察结核杆菌抗原(Mtb-Ag)对人γδT细胞体外增殖的影响,以解决医学研究中γδT细胞来源不足问题。方法应用酸性改良罗氏培养基分离培养结核杆菌及丙酮酸钠液体培养基进行扩增,通过85℃水浴灭活,超声波细胞破碎制备Mtb-Ag。在体外以不同的剂量刺激人外周血单个核细胞(PBMC),采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测增殖程度,应用流式细胞仪检测γδT细胞增殖的百分率。结果在一定范围内随着刺激剂量的增加PBMC增殖亦增加。流式细胞仪分析增殖结果显示,7μg/ml刺激组γδT细胞的增殖率最高(约为49.08%)。但当刺激剂量增加至9μg/ml时,γδT细胞增殖比率开始降低(约为32.62%),而αβT细胞增殖比率增加明显(约为36.76%)。结论Mtb-Ag在合适刺激剂量时,可对人γδT细胞发挥优势扩增;当剂量过大时则对αβT细胞发挥优势扩增。

结核杆菌抗原诱导的人γδT细胞表达L-选择素的调控机制

采用CD62L生物素-链霉亲和素染色流式细胞术检测L-选择素在细胞表面表达的方法，分别观察新鲜PBMC和刺激后培养3～21d的γδT细胞表面L-选择素的表达，并研究培养6～7d的MtbAT预先用LY294002（PI3K途径抑制剂）、SB203580（p38途径抑制剂）、PD98059（MEK抑制剂）分别处理20min，然后用Mtb-Ag再刺激3h时γδT细胞表面L-选择素的表达情况。结果显示新鲜PBMC中γδT细胞L-选择素的表达率为（43．9％±6．7％），γδT细胞L-选择素的表达率为（76．6％±7．9％），有显著差异（P〈0．05）。用Mtb-Ag激活后培养第6天时L-选择素在γδT细胞的表达达到高峰（90．7％）；以后L-选择素表达逐渐下降，15～21dγδT细胞L-选择素的表达在低水平（16．2％～10．6％）维持；Mtb—Ag再刺激MtbAT诱导γδT细胞L-选择素表达下调为69．5％，预先加入LY294002或PD98059，则L-选择素表达率分别为83．1％和78．7％；而加入SB203580未见明显影响。提示γδT细胞活化时L-选择素表达调控与PI3K、Ras／Erk途径有关，但与p38MAPK途径无关。

结核杆菌抗原诱导成纤维细胞水通道蛋白1(AQP1)表达的调节

目的：观察结核杆菌抗原（MTb-Ag）对BALB/c 3T3成纤维细胞水通道蛋白1（AQP1）表达的影响及其调节机制。方法：采用免疫印迹技术和免疫荧光检测细胞的AQP1和微管相关蛋白轻链3（LC3）,实时定量PCR测定AQP1 mRNA含量,倒置显微镜观察细胞形态学变化。结果：低浓度MTb-Ag（10 mg/L）与细胞作用24~72 h后诱导细胞AQP1表达分别增加了74.46%、70.84%及93.89%（P〈0.01）,且细胞增长速度加快;而高浓度MTb-Ag（30 mg/L）并未诱导细胞AQP1表达增加。免疫荧光也证实低浓度的MTb-Ag诱导了细胞AQP1的显著增加。低浓度MTb-Ag（10 mg/L）作用于细胞24~72 h,均未检测出AQP1 mRNA的差异变化,但细胞的自噬反应显著增加。结论：MTb-Ag可诱导BALB/c 3T3成纤维细胞AQP1表达的显著增加,这种增加在于基因转录后的调节,而细胞的自噬途径可能参与其中。

结核杆菌抗原激活MEK-ERK信号通路延迟中性粒细胞自发性凋亡的作用

探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)对中性粒细胞自发性凋亡的影响。取健康成人外周血分离中性粒细胞,加Mtb-Ag培养24 h,或用Mek抑制剂PD98059预处理30 min,Annexin V染色流式细胞术观察细胞凋亡;并用Western blot印迹法检测Mek活化情况。与中性粒细胞体外培养24 h后自发凋亡(55%±6%)相比,加入Mtb-Ag(1.125 mg/ml)后,中性粒细胞凋亡率(31%±3%)明显降低;并且Mtb-Ag可诱导Mek的激活;而PD98059(50μmol/L)预处理可阻断Mtb-Ag的抑制凋亡作用。Mtb-Ag对中性粒细胞自发凋亡有抑制作用,这一作用涉及Mek-Erk途径。

结核杆菌抗原对中性粒细胞自发性凋亡的抑制作用

目的:探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)对体外培养中性粒细胞自发性凋亡的影响。方法:取健康成人外周血分离中性粒细胞,加Mtb-Ag培养24 h,或用Mek抑制剂PD98059预处理30 min后,Wright-Giemsa染色形态学方法和Annexin-V染色流式细胞术观察细胞凋亡。结果:与中性粒细胞体外培养24 h后自发凋亡(55±10)%相比,加入Mtb-Ag(1.125 mg/ml)后,中性粒细胞自发凋亡率(31±3)%明显降低(P<0.01);Mek抑制剂PD98059(50μmol/L)可阻断Mtb-Ag的抑制凋亡作用(P<0.01)。结论:Mtb-Ag对中性粒细胞自发性凋亡有抑制作用,这一作用可能涉及Mek-Erk途径。

脑脊液结核杆菌抗原及核酸联合检测对结核性脑膜炎早期诊断的评价

目的:结核性脑炎是目前临床上常见的疾病,也是结核病中最严重的病型。由于结核分枝杆菌生物性状的特珠性,致使本病在临床上诊断较为困难,同时早期诊断和及时抗痨治疗,对本病的疗效起着重要的作用,目前本病还没有一个统一的诊断标准。常规方案是根据临床(A)、脑脊液常规(B)、头颅CT(C)、神经系以外结核(D),一般都是采取综合的方法进行判断,依据数据多,所需时间长,对本病的疗效影响很大,探讨一种便于早期诊断、特异性高、操作简单的方法,是临床迫切解决的问题;据报道单独利用PCR技术检测脑脊液中的核酸提高检出率,亦有检测结核杆菌原来提高检出率,都收到了一定的效果,但仍不理想。方法:自2008年至2010年间住院的脑膜炎的病人150例,在常规做脑脊液检查的同时,保留脑脊液标本,集中测定结核杆菌核酸和结核杆菌抗原结果。结果两项试验同时阳性者占65%,核酸阳性而抗原阴者占20%,核酸阴性抗原阳性者占7.5%。结果:①说明两试验有相同的诊断份值,②说明,但阳性率还只能满足临床要求;③三种阳性模式总阳性率为92.5%,与阴对照组相比有显著差异,(P<0.01);结论:对于该病的早期诊断有很大的意义。

新型结核杆菌抗原的免疫原性和保护效力

鉴于结核病仍然是全球人类发病和死亡的主要原因,故迫切需求一种新的疫苗。结核亚单位疫苗已经显示出在人类能诱导强有力的免疫应答,并在HIV地方流行区可作为一种BCG的替代疫苗加以使用。在这项研究中,作者研究了16种不同的新的结核分枝杆菌抗原的保护效力,作者采用肺部结核病小鼠模型进行此项研究。这些抗原被用来作为亚单位疫苗而与双十八烷基溴化铵（DDA）-D（＋）同海藻糖6.6 dibenenate（TDB）（DDA/TDB）佐剂配制成制剂，作为单价疫苗接种小鼠或者多价联合疫苗接种小鼠，

基于结核杆菌耐热抗原小分子多肽刺激人外周血T细胞产生TNF-α和IFN-γ鉴别肺结核和潜伏性结核感染

目的研究结核杆菌耐热抗原小分子多肽(Mtb-HAg-10k)刺激人外周血T细胞产生细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的作用特点及肺结核患者和潜伏性感染者IFN-γ产生细胞的数量差异,初步探讨Mtb-HAg-10k作为诊断抗原鉴别肺结核和潜伏性结核感染的可行性。方法以超滤离心法获得的Mtb-HAg-10k为刺激剂作用于人外周血单个核细胞(PBMCs),并以Mtb-HAg、植物血凝素PHA作为对照,用多色流式细胞术检测T细胞亚群中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例,酶联免疫斑点法检测肺结核患者和潜伏性感染者PBMCs中IFN-γ产生细胞数量。结果流式细胞术检测人外周血Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞中TNF-α产生细胞比例显著高于IFN-γ产生细胞比例(P<0.01);与PHA刺激组相比,γδT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例增高(P<0.01),而αβT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例显著降低;酶联免疫斑点法检测Mtb-HAg-10k刺激的健康者PBMCs中IFN-γ产生细胞数量低于Mtb-HAg刺激组和PHA对照组(P<0.01);肺结核患者IFN-γ产生细胞数量低于潜伏性结核感染者(P<0.01)。结论以Mtb-HAg-10K为刺激剂可使人外周血γδT细胞优势产生TNF-α和IFN-γ,通过酶联免疫斑点法检测PBMCs中IFN-γ产生细胞数量差异有助于鉴别肺结核和潜伏性结核感染。

毛细管电泳法检测结核杆菌蛋白多肽类抗原活性成分研究

采用毛细管电泳法分离检测结核杆菌耐热抗原样品中的活性成分。熔融石英毛细管55cm(40cm处检测窗口)×50μm i.d.;缓冲液:0.15mol·L-1硼酸盐(含5g·L-1PEG-4000,pH=10.92);分离电压:+12 kV;进样压力:0.5 psi(3.45 kPa),进样时间3.0s;分离温度:25℃;UV-Vis检测器检测波长:200nm。本方法能分离溶菌酶标准蛋白和牛血清白蛋白标准品,根据分子量大小能有效分离结核杆菌耐热抗原样品活性成分,线性回归方程相关系数r2在0.99673以上,定量限在19.47μg·mL-1左右。样品加标回收率在96.09%左右,相对标准偏差小于8.13%,本方法与快速蛋白液相色谱法结果一致。该方法简便、灵敏、快速、可靠、重现性好,能用于结核杆菌耐热抗原样品中活性成分测定。

评估人T淋巴细胞亚群对结核杆菌脂质抗原的免疫反应

目的:观察结核杆菌脂质的一些脂类抗原对人外周血中淋巴细胞活化和增殖的作用,进而探讨脂类抗原在结核感染中是否存在特异性的免疫作用。方法:取健康人外周血单个核细胞(PBMC),分离诱导出非成熟树突状细胞(im DC)后分别加入结核杆菌脂质全脂质(TLIP)、丙酮可溶性脂质(ASLIP)、纯硫脂(PSLIP)、脂阿拉伯糖(LAM)、脂甘露聚糖(LM)、同时设置非脂类抗原全菌裂解物(WCL)、培养分泌蛋白(CFP)、耐热抗原(Mtb-HAg)、脂多糖(LPS)和空白对照组。用CFSE标记自体淋巴细胞后,与被脂质抗原刺激后的DC共培养。之后,用流式细胞仪(FCM)检测T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、NKT和γδT)的增殖和分泌细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-4)的情况。结果:相较于空白组,所有脂质都能促进NKT细胞和CD8+T细胞增殖(P<0.05)。相较于空白组ASLIP,LAM和LM可以促进非增殖的CD4+T细胞分泌IL-4,或者促进增殖的CD4+T细胞分泌IFN-γ(P<0.05)。相较于空白对照组,所有脂质抗原(除了LM)都能促进增殖的γδT和CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α,而LM能抑制增殖的CD8+T细胞分泌TNF-α。结论:结核杆菌脂质抗原能激活PBMC的特异性免疫反应,特别是CD1限制性T细胞的应答。

神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原诱导的γδT细胞活化及凋亡作用

目的 :研究神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原 (Mtb)诱导的γδT细胞活化及凋亡作用。方法 :用结核杆菌低分子多肽抗原刺激正常人PBMC ,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδT细胞。通过MTT试验观察神经酰胺、鞘磷脂酶以及神经酰胺合成酶抑制剂FumonisinB1对γδT细胞的活化作用 ;FACS检测其对γδT细胞的凋亡作用。结果 :Mtb刺激获得的γδT细胞可达 73 % ,磁珠分选后可高达 98% ;高浓度神经酰胺及鞘磷脂酶能抑制γδT细胞的增殖 ,而出现凋亡 ,FumonisinB1则对γδT细胞的增殖及凋亡无明显影响。结论

结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ＋T细胞的细 …

目的 探讨选择性扩增人γδ＋Ｔ细胞的方法及其细胞毒性。方法 用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原（Ｍｔｂ）刺激正常人ＰＢＭＣ，并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ＋Ｔ细胞，通过ＭＴＴ试验观察γδ＋Ｔ细胞对人红白细胞白血病细胞株Ｋ５６２的细胞观察γδ＋Ｔ细胞对人红白细胞白血病细胞株Ｋ５６２的细胞毒活性。结果 Ｍｔｂ刺激及磁珠分选后的γδ＋Ｔ细胞可达７３％和９８％。

嗜乳脂蛋白3A1(BTN3A1)促进结核杆菌耐热抗原诱导的人外周血Vγ9Vδ2 T细胞活化增殖

目的初步探讨嗜乳脂蛋白3A1(BTN3A1)在结核杆菌耐热抗原(MTB-HAg)诱导的人外周血Vγ9Vδ2 T细胞活化增殖中的作用。方法人外周血单个核细胞(PBMC)先加BTN3A1阻断性抗体作用3 h,再分别用MTB-HAg和磷酸类抗原(PAg)刺激培养24 h后收集细胞,用流式细胞术检测Vγ9Vδ2 T细胞中CD69表达;或刺激20 h后收集细胞,检测Vγ9Vδ2 T细胞中1型辅助性T(Th1)细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)产生细胞比例;或刺激后,在含白细胞介素2(IL-2)培养液中培养10 d后,收集细胞检测Vγ9Vδ2 T细胞扩增比例及增殖活性。结果MTB-HAg刺激后,Vγ9Vδ2 T细胞中CD69平均荧光强度和阳性细胞比例在BTN3A1阻断组均明显下降(为刺激组的13.84%和43.00%);而PAg阻断组的CD69平均荧光强度和阳性细胞比例显著被抑制(为刺激组的3.10%,4.47%和9.53%,10.91%)。MTB-HAg刺激后Vγ9Vδ2 T细胞中IFN-γ和TNF-α产生细胞比例在BTN3A1阻断组显著减少,Vγ9Vδ2 T细胞扩增数量和细胞增殖活性在BTN3A1阻断组也显著减少或降低。与PAg阻断组明显被抑制的结果相似。结论BTN3A1促进MTB-HAg诱导的外周血Vγ9Vδ2 T细胞活化增殖。

结核杆菌耐热抗原对人外周血淋巴细胞NKG2A/NKG2D的影响

目的:以结核杆菌耐热抗原为刺激剂,观察人外周血淋巴细胞NKG2A受体和NKG2D受体表达量的变化情况。方法:用结核杆菌耐热抗原刺激人外周血淋巴细胞,用流式细胞技术检测NKG2A受体和NKG2D受体的变化。使用RT-PCR和ELISA检测PBMCs中IFN-γ的表达情况。结果:在IL-2和抗原联合刺激下,NKG2A受体的表达量在第12天大幅度上升,NKG2D受体的表达量始终变化不大。NKG2A受体的表达在T细胞、NK细胞、αβT细胞和γδT细胞表面都有不同程度的增加。结论:NKG2A/NKG2D比例的上升有可能会对免疫系统造成一些影响,其中IFN-γ起着不可忽视的作用。

结核杆菌耐热抗原和磷酸类抗原对人外周血γδ T细胞活化和增殖的比较

目的:比较结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)和磷酸类抗原(HDMAPP)刺激正常人外周血γδT细胞活化和增殖的特点。方法:健康成人外周血单个核细胞(PBMC,1×106/ml),分别加Mtb-HAg(5μg/ml)和HDMAPP(2×10-9mol/ml)进行刺激,同时给予IL-2(50 u/ml)维持细胞增殖,另外设立只加IL-2的对照组。培养10 d后,采用抗CD3-FITC和抗TCRγδ-PE荧光抗体标记细胞,流式细胞术检测γδT细胞的比例。结果:正常人PBMC经Mtb-HAg刺激扩增后γδT细胞在扩增细胞中的比例明显低于HDMAPP组(P<0.01),均明显高于IL-2对照组(P<0.01)。各个体对2种抗原刺激扩增γδT细胞呈线性正相关关系(R2=0.855 1,P<0.01)。结论:Mtb-HAg和HDMAPP均可优势激活人γδT细胞,且后者较前者有更强的活性。